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第2节
动物细胞工程（二）
Section 2 Animal Cell Engineering (2)
Fusion of animal cells and preparation of monoclonal antibody
初识单克隆抗体
温故知新
什么是抗体？
什么是单克隆抗体？
01.
02.
抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激由浆细胞分泌的具有保护作用的一种免疫球蛋白。
单克隆抗体是由单一B细胞产生的高度专一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高的特点
产量低、纯度低、特异性差
制备过程分析
理性分析
锁定所需要的B细胞
利用基因工程手段制备工程菌
通过分子生物学手段检测产生特定抗体的基因
通过培养微生物使其产生抗体
视频笔记
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
分离、提纯、剪切、拼接等基因操作技术手段复杂
基因工程对仪器设备等到要求很高
寻求细胞工程手段
为何不直接培养相应的B淋巴细胞以获得单克隆抗体？
需要对B淋巴细胞进行怎样的改造？
根据材料，你能得到什么样的启示？
早在19世纪, 人们就发现在自然条件下生物界中有“自发”的细胞融合现象。Muller( 1838年 ) 在 肿瘤中观察到了多核细胞, 此后在由病毒感染的病人 组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞
动物细胞融合技术
概念 动物细胞融合技术（cell fusion technique）就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
结果 形成杂交细胞。即融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息
动物细胞融合技术
问题1
动物细胞融合的原理（理论基础）？
问题2
动物细胞融合成功的标志？
问题3
从方法步骤、诱导手段、用途方面比较植物体细胞杂交和动物细胞融合过程的区别
关于灭活病毒诱导法
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
灭活病毒
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的
蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打
开，细胞发生融合。
诱融原理
动物细胞融合技术的意义
意义
细胞融合技术克服了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合
动物细胞融合技术
问题1
动物细胞融合的原理（理论基础）？
问题2
动物细胞融合成功的标志？
问题3
从方法步骤、诱导手段、用途方面比较植物体细胞杂交和动物细胞融合过程的区别
动植物细胞工程相似技术对比
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
依据原理
细胞融合的方法
诱导方法
用途
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
电融合法、离心法
聚乙二醇融合法、电融合法和灭活病毒诱导法
主要用于制备单克隆抗体
聚乙二醇融合法、高Ca+—高PH融合法
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段
单克隆抗体的制备过程
理性分析
1.单克隆抗体制备过程涉及几种动物细胞工程技术手段？
2.将特定抗原注入到小鼠体内的目的？
3.②过程能产生几种类型的杂交细胞？如何从中筛选出③？
4.得到④之后还需要进一步筛选吗？
单克隆抗体的制备过程
杂交瘤细胞的选择原理
HAT培养基
筛选杂交瘤细胞所使用的特定培养基
H
A
T
次黄嘌呤（hypoxanthine）
氨基蝶呤
(aminopterin)
胸腺嘧啶核苷
（thymidine）
氨基蝶呤能阻断所有细胞合成DNA的合成途径（D途径）
当D途径被阻断后，细胞中的HGPRT酶和TK酶能利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷进行补救途径的DNA合成（S途径）
实验中选择的骨髓瘤细胞中缺乏HGPRT酶和TK酶
背景材料
杂交瘤细胞的选择原理
HAT培养基
B
BB
和
A
AA
和
AB
高度分化的细胞一般不具备分裂能力
D途径受阻，且不能利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷进行S途径补救
D途径受阻，但能通过B细胞带来的HGPRT和TK利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷进行S途径补救
死
死
活
单科隆抗体的制备过程
理性分析
1.单克隆抗体制备过程涉及几种动物细胞工程技术手段？
2.将特定抗原注入到小鼠体内的目的？
3.②过程能产生几种类型的杂交细胞？如何从中筛选筛选出③？
4.得到④之后还需要进一步筛选吗？
单科隆抗体的制备过程
对产生特异性杂交瘤细胞的选择
96孔板
原理
在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养
利用抗体和特定抗原结合的原理，检测呈阳性的杂交瘤细胞
典型例题
例2 为研制抗病毒 A 的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。下列叙述错误的是( )
A. 筛选 2 含多次筛选，基本原理与
筛选 1 相同
B. 为了诱导小鼠甲产生特异性的 B
淋巴细胞，可以对其注射病毒 A
C. 利用仙台病毒或聚乙二醇等作介导，
融合 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞
D. 为了克隆阳性杂交瘤细胞，可将其注射到小鼠腹腔内增殖并获得大量单抗
单克隆抗体中的两次选择
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等
用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。
筛选出融合的杂种细胞
选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
对杂交瘤细胞的克隆
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体的应用
研究分析
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，被广泛应用于疾病的诊断和治疗。
单克隆抗体被广泛用作诊断试剂
单克隆抗体用于疾病诊断和病原体鉴定
单克隆抗体直接用于治疗疾病
单克隆抗体用以制备“生物导弹”
用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
单克隆抗体被广泛用作诊断试剂
单克隆抗体诊断试剂盒在临床应用上的优势
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒
使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤
单克隆抗体用以制备“生物导弹”
单克隆抗体诊断试剂盒在临床应用上的优势
ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
单克隆抗体用于疾病诊断和病原体鉴定
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体
利用成像技术观察单克隆抗体与病变部位或病原体结合所在部位
单克隆抗体直接用于治疗疾病
利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。
利妥昔单抗进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位
跟踪训练
4. （2021河北衡水十四中高二期末）由单克隆抗体研制而成的“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是杀伤性“弹头”，下列对此描述不正确的是( )
A. “弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能
B. “弹头”由放射性同位素、化学药物或毒素等物质构成
C. “瞄准装置”由识别肿瘤的单克隆抗体构成
D. “生物导弹”是利用细胞工程制出来的

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