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第2节 基因工程的基本操作程序
操
作
程
序
基因工程
Basic operating procedures of genetic engineering
第2节 基因工程的基本操作程序
操
作
程
序
基因工程
Basic operating procedures of genetic engineering
基因工程的基本操作流程图
Basic operation flow chart of genetic engineering
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
Stress resistance gene
抗逆性基因
Production of drug genes
生产药物基因
Toxicant degradation gene
毒物降解基因
Industrial enzyme gene
工业用酶基因
目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因
VS
结构基因
凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋白质的基因都称为结构基因
调节基因
凡是编码阻遏或激活结构基因转录的调节因子的基因都称为调节基因
目的基因主要通过编码蛋白质来实现的，但是有些目的基因是具有调控作用的因子，导入这种目的基因不是为了编码蛋白质，而是为了调控其他基因的表达。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
筛选方法
从相关的
已知结构
和功能清晰
的基因中进行筛选
已知结构
科学家掌握了Bt基因的序列信息
功能清晰
Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
测序技术
测定核酸和蛋白质序列
序列数据库
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
序列比对工具
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成
化学方法直接人工合成
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
在基因拼接技术中，直接分离目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”
从生物组织中直接获取
用多种限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来
用"鸟枪法"获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
从基因文库中获取目的基因
基因组文库 含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体
cDNA文库 含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体
选择含有目的基因的克隆，用构建文库时的限制酶切割获得目的基因
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
发明者 穆里斯
PCR是聚合酶链式反应的缩写
概念 依据半保留复制，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
利用PCR技术扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液等
特别说明 PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
90℃高温 DNA在体外90℃高温时变性会变成单链
50℃低温 引物与单链按碱基互补配对的原则结合
72℃适温 DNA聚合酶在最适反应温度，沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链
反应原理 DNA半保留复制
反应条件 缓冲液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
重复循环
复性
变性
延伸
温度：超过90℃
温度：50℃左右
温度：72℃左右
目的基因DNA受热变性后解旋为单链
两种引物通过互补配对与单链DNA结合
以DNA单链为模板在Taq酶的作用下延伸
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
结果 1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数方式扩增，可以扩增出2n个DNA片段。
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是：
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物
1.引物设计不能太长也不能太短（20～30个核苷酸）
2.引物之间或引物内部不能发生互补配对
3.严格控制引物中CG含量
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
例1 （2020安徽师范大学附属中学高二期中）关于 PCR 技术的说法不正确的是( )
A. PCR 技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
B. PCR 过程中只需要两个引物分子
C. PCR 的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的 DNA 聚合酶
D. PCR 过程中 DNA 合成方向是 5′到 3′
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
PCR扩增DNA规律
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中，不等长链DNA分子数为：_____个
②子代DNA分子中，等长链DNA分子数为：______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个
⑤复制过程中共需引物_______个
⑥第n次复制需要引物___个
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR扩增DNA规律
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
PCR扩增DNA规律
一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
①子代DNA分子中，不等长链DNA分子数为：_____个
②子代DNA分子中，等长链DNA分子数为：______个
③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个
⑤复制过程中共需引物_______个
⑥第n次复制需要引物___个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
（2020辽宁阜新实验中学高二月考）利用 PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内 DNA 复制类似（如图所示）。图中引物为单链 DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A. 第四轮循环产物中 PCR 技术扩增出的两条链等长
的目的基因片段只有8个
B. 设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对
而造成引物自连
C. 复性温度过高可能导致 PCR 反应得不到任何扩增
产物
D. 第四轮循环产物中同时含有引物 A 和引物 B 的 DNA 片段所占的比例为15/16
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照参数表，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
移液
离心
扩增
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
电泳鉴定
在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳
PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
影响DNA迁移速率的因素
凝胶的浓度
电压大小
DNA分子大小和构像
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
在模具中插入合适大小的梳子，以形成加样孔。然后将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
例3 （2021江苏南通高二期末）在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶（ R1 和 R2 ）处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的
是( )
A. 电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极
B. 该载体最可能为环形 DNA 分子
C. 限制酶 R1 与 R2 的切点最短相距约 200 bp
D. 两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
化学方法直接人工合成
从生物组织中直接获取
从基因文库中获取目的基因
利用PCR技术扩增目的基因
从相关的
已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
基因表达载体的构建
Construction of gene expression vector
导入前的准备
获取了足够量的目的基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用
一般不能直接导入到受体细胞
理由 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
基因表达载体的构建
Construction of gene expression vector
地位 基因工程的核心工作
组成
复制原点
标记基因
启动子
终止子
目的基因
基因表达载体的构建
Construction of gene expression vector
2. （2021湖北荆州中学高二期末）下列有关说法正确的是( )
A. 用限制酶酶切获得一个目的基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B. 目的基因可从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选
C. 表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点
D. 有时为了满足应用需要，在载体中人工构建诱导型启动子，可抑制目的基因的表达
基因表达载体的构建
Construction of gene expression vector
例2 研究人员用图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒（图中标注了相关限制酶切割位点），将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及 PCR 鉴定。以下叙述不正确的是( )
A. 构建重组质粒的过程应选用 Bcl Ⅰ 和 Hin dⅢ 两种限制酶
B. 使用 DNA 连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组
C. 能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌
D. 利用 PCR 鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
转化的实质是将目的基因整合到受体细胞基因组中
花粉管通道法
导入植物细胞
显微注射法
导入动物细胞
Ca2+处理法
导入微生物细胞
农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
花粉管通道法
花粉管通道法 是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的
方法1
方法2
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
导入
受精卵
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力
关于农杆菌
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上；
T-DNA
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
思路将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株
将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等
导入体细胞
导入受精卵
两次拼接和两次导入
第一次拼接 是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接 指被插入目的基因的T -DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
第一次导入 是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入 是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
转化方法的突破
随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
导入细菌（细菌转化方法）
一般用Ca2+处理使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态），然后将重组的基因表达载体导入其中。
导入动物细胞（动物细胞转化方法）
常用显微注射法将目的基因注入受精卵
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
1. 下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )
A. 将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物
B. 显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C. 大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D. 农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
将目的基因导入受体细胞
The target gene into the recipient cell
例1 如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是( )
A. ⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B. ③侵染植物细胞后，重组 Ti 质粒整合到④的染色体上
C. 若④的染色体上含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D. ②的构建需要限制性内切核酸酶和 DNA 聚合酶参与
学以致用 如何制备能生产人胰岛素的大肠杆菌？
How to produce human insulin-producing E. Coli
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
加工
成熟胰岛素
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
目的 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
检测内容及方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
PCR等技术，“等”到底指的是哪些技术
“等”之一
“等”之二
电泳技术
基因探针技术
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
电泳技术 在目的基因的检测和鉴定中的应用
思路 将受体细的所有DNA分子提取出来进行电泳实验，与marker对比判断是否含目的基因。
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
思考 1.理论上电泳技术即达目的，为何还要PCR？
2.可以用此方法检测目的基因是否转录出了mRNA吗？
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
电泳技术 在目的基因的检测和鉴定中的应用
思路 在反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在Taq酶的作用下扩增合成目的片段。
此法被称为RT—PCR技术也
RT—PCR技术可用于检测细胞中基因表达水平、检测机体RNA病毒的感染情况等
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
PCR等技术，“等”到底指的是哪些技术
“等”之一
“等”之二
电泳技术
基因探针技术
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
初识基因探针
定义 基因探针是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
检测 将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因
思考 1.荧光或同位素检测结果的强度应该与什么有关？
2.如何检测核酸杂交分子的存在？
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
2.提取受体细胞全部RNA逆转录形成cDNA，与基因探针置于同一培养液，并用PCR扩增；
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
PCR扩增和分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNA
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
3. 荧光定量 PCR 技术可定量检测样本中某种 DNA 含量。其原理是：在 PCR 反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针，荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统接收不到荧光信号。当 Taq 酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图所示）。相关叙述正确的是( )
A. 扩增过程中引物先于探针结合到模板 DNA 上
B. 在 PCR 反应系统中需加入 DNA 解旋酶
C. 荧光信号积累越多，说明 PCR 循环次数越多
D. 若扩增 n 次，则共需要消耗 2n 1 个探针
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增
2.提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液
3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段
PCR扩增和DNA分子杂交技术检测DNA上是否插入了目的基因
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
目的 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
检测内容及方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
2. （2020天津耀华中学高二期末）筛选是生物技术中的一个重要环节。下列叙述正确的是( )
A. 基因工程中，利用目的基因对受体细胞进行筛选
B. 通过在培养基中添加抗生素，可以初步筛选出含有质粒或重组质粒的受体细胞
C. 检测目的基因能否稳定遗传的关键是看目的基因是否成功构建为基因表达载体
D. 只要检测到目的基因成功表达出蛋白质，就证明基因工程取得成功
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
例2 （2020浙江7月选考，24，2分）下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A. 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B. 抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C. 抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其 DNA 检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因 RNA
D. 已知不同分子量 DNA 可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
6. 如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图,请回答：
（1） A→B利用的技术称为______，其中②过程需要耐高温的__________酶才能完成。
（2） 图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。
（3） 上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是____________法，该方法一般________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。
DNA聚合
基因表达载体
农杆菌转化
不适宜
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
6. 如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图,请回答：
（4） 欲确定抗虫基因在 G 体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的 DNA 整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占___________。
抗虫鉴定
3/4
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target gene
思考 研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？
转两个T基因
普通棉花细胞
甲
乙
丙
若受体细胞为受精卵，则甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？
甲自交→全为抗虫
乙自交→抗虫：不抗虫=3:1
丙自交→抗虫：不抗虫=15:1

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