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专题10　生物工程
微专题2　基因工程(含PCR技术)
1.基因工程的基本工具
①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
②若用两种不同的限制酶同时切割目的基因和同时切割载体，则可使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。
2.基因工程的四个操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
　①目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
②在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。
③当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
①启动子、终止子
a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子连接到一起，再通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
(3)将目的基因导入受体细胞
细胞类型 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射技术 Ca2＋处理法(感受态细胞法)
受体细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞 使用最广泛的是大肠杆菌
辨析农杆菌转化法中的“两个两次”
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T DNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定
3.PCR技术及应用
(1)PCR技术原理与条件
(2)PCR技术的过程
可通过引物控制PCR扩增的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
4.蛋白质工程
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1.(2021·辽宁卷，4)下列有关细胞内的DNA及其复制过程的叙述，正确的是(　　)
A.子链延伸时游离的脱氧核苷酸添加到3′端
B.子链的合成过程不需要引物参与
C.DNA每条链的5′端是羟基末端
D.DNA聚合酶的作用是打开DNA双链
答案　A
解析　细胞内DNA复制时，子链延伸方向为5′→3′，故游离的脱氧核苷酸添加到3′端，A正确；子链的合成过程需要引物参与，B错误；DNA每条链的5′端是磷酸基团末端，3′端是羟基末端，C错误；解旋酶的作用是打开DNA双链，D错误。
2.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
答案　D
解析　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
3.(2021·江苏卷，13)下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是(　　)
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
答案　D
解析　农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体的DNA上，A正确；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了四种类型细胞，其中包括目的基因与标记基因都不含的、只含目的基因的、只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。
4.(2020·江苏卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化______________________________________________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A.5′－AACTATGCG┈┈AGCCCTT－3′
B.5′－AATTCCATG┈┈CTGAATT－3′
C.5′－GCAATGCGT┈┈TCGGGAA－3′
D.5′－TTGATACGC┈┈CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链
以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′—羟基和5′—磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，TaqDNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(引物④)和5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为－AATT，3′端序列应为－TTAA，B正确。
5.(2019·江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。
菌落类型 平板类型　　　　 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接　(3)B　A菌落含有P0　C类菌落未转入质粒　(4)乙、丙　目的基因反向连接
解析　(1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的载体质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P2质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P2质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P2质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。

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