资源简介

(共29张PPT)
第1节 重组DNA技术的基本工具
第3章基因工程
1944年
1950年
1953年
1958年
1961年
1967年
1944年，艾弗里（O. Avery, 1877-1955)等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年，埃德曼（P.V.Edman,1916-1977)发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013)首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。
1953年，沃森（J.D.Watson,1928-)和克里克（F.Crick,1916-2004)建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1958年，梅塞尔森（M. Meselson, 1930-)和斯塔尔（F. W. Stahl,1929-)用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。
1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg,
1927-2010)和马太（J. H. Matthaei，1929一）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
基因工程的诞生和发展
1970年
20世纪70年代初
1972年
1973年
1977年
1982年
1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年，伯格（P.Berg,1926-)首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA,导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物－重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1983年
1984年
1985年
1990年
21世纪以来
2013年
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
1984年，我国科学家朱作言（1941-)领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯（K. Mullis, 1944-2019)等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
1990年，人类基因组计划启动。2003年改计划的测序任务顺利完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋（1982-)及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术－CRISPR(成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
本节聚焦
1.重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
2.基因工程载体需要具备什么条件？
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
（1）所用的分子工具：限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体。
（2）限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。
DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。
载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.限制酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的
2.作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
3.作用部位：磷酸二酯键，限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
4.作用特点：
（1）具有专一性
①识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
②切割特定序列中的特定位点
（2）可用于切割DNA获取目的基因和切割载体
双链DNA的结构和磷酸二酯键的位置示意图
限制酶切割DNA分子产生两种不同末端的示意图
（箭头表示酶的切割位置）
资料卡
（1)限制性内切核酸酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（2)区别限制酶的特异性和专一性：
①限制酶的特异性是指一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子；
②限制酶的专一性是指其只能切割DNA,而不能作用于RNA、蛋白质等其他底物。不同种类的限制酶识别的序列和切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
2.DNA连接酶的作用：可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
1.DNA连接酶的种类和特点
种类 E.coil DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只能连接双链DNA 片段互补的黏性末端 既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低
思考：
切割后的两条DNA链连接时为什么要对DNA连接酶进行选择？
E·coil DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，不能连接平末端。而T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，所以必须根据被限制酶切割后产生的末端进行选择。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.载体的作用：
（1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
（2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.作为载体的必要条件：
（1）能在受体细胞中复制并稳定保存
（2）具有一个至多个限制酶切割位点
（3）带有特殊的标记基因
（4）对受体细胞无害
（3）常用载体——质粒
①质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
③质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。
④在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上经过人工改造的。
大肠杆菌及质粒结构模式图
常用载体的种类及用途
种类 用途
质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
λ噬菌体的衍生物 植物病毒 将外源基因导入植物细胞
动物病毒 将外源基因导入动物细胞
思考·讨论 P73
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶，透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互相配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。
四、DNA的粗提取与鉴定
1.提取DNA的基本思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理和化学方法对它们进行提取
2.DNA粗提取的原理
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
思考：
1.过滤时能否用滤布代替纱布？
2.如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提前的DNA量
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量减少，影响最终提取的DNA量
课堂练习
1.如图所示限制性核酸内切酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制性核酸内切酶能识别的碱基序列及切点是( )
A.CTTAAG，切点在C和T之间 B.CTTAAC，切点在G和A之间
C.GAATTC，切点在G和A之间 D.CTTAAG，切点在C和T之间
C
2.下列关于基因工程的有关叙述，正确的是( )
A.基因工程常用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、载体
B.一种限制酶能识别几种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA
C.质粒是一种常用载体，是拟核或细胞核外能自主复制的很小的环状DNA分子
D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制
3.以下关于基因工程操作工具的叙述，正确的是( )
A.DNA连接酶能够催化核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键
B.限制酶能识别并切割DNA分子内一段特定的核苷酸序列
C.质粒一般具有复制原点、酶切位点和抗生素合成基因等
D.DNA聚合酶可将目的基因和载体连接形成重组DNA
C
B
4.某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述错误的是( )
酶a切割产物（bp） 酶b再次切割产物（bp）
2100；1400；1000；500 1900；200；800；600；1000；500
A.酶a与酶b切断的化学键相同
B.酶a与酶b切出的黏性末端能相互连接
C.酶a与酶b在该DNA分子上的切割位点数分别为3个和5个
D.限制酶将1个DNA分子片段切成2个片段需消耗2个水分子
C
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