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高中生物（新人教版）·选择性必修三-知识点
1.1　传统发酵技术的应用-知识点
【基础知识】
知识点一　发酵与传统发酵技术
1．发酵
(1)概念：是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
(2)原理：不同的微生物具有产生不同代谢物的能力，利用它们就可生产出人们所需要的多种产物。
2．传统发酵技术
(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
(2)方式：以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
(3)利用传统发酵技术制作的食品
②其他：酒、酱、酱油、醋、泡菜和豆豉等。
知识点二　制作传统发酵食品的微生物
1．乳酸菌
(1)生物类型：细菌。
(2)代谢类型：异养厌氧型菌。
(3)常见的种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌两种。
(4)分布：在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物肠道内都有分布。
(5)发酵原理：
在无氧条件下，乳酸菌经无氧呼吸将葡萄糖分解为乳酸。反应式：C6H12O62C3H6O3(乳酸)＋能量。
(6)应用：乳酸菌可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。
2．酵母菌
(1)生物类型：单细胞真菌。
(2)代谢类型：异养兼性厌氧型。
(3)分布：一些含糖量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。
(4)生长温度：酿酒酵母的最适生长温度约为28℃。
(5)酒精发酵的反应式：C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量
(6)应用：在无氧条件下可以进行酒精发酵，可用于酿酒、制作馒头和面包等。
3．醋酸菌
(1)生物类型：细菌。
(2)代谢类型：异养需氧型。
(3)生长温度：多数醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃。
(4)发酵原理：①当氧气和糖源都充足时，醋酸菌能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸。
反应式：C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2CO2＋2H2O＋能量。
②当氧气充足，缺少糖源时，醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。
反应式：C2H5OH＋O2CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量
知识点三　尝试制作传统发酵食品
1．制作泡菜
(1)菌种来源：植物体表面天然乳酸菌。
(2)泡菜制作原理：在发酵期间，乳酸菌发酵，乳酸会不断积累，当它的质量分数为0.4%～0.8%时，泡菜的口味、品质最佳。
(3)制作过程
(4)泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡，因此需要跟踪检测制作过程中亚硝酸盐含量的变化，探索腌制方法、时间长短和温度高低等条件对亚硝酸盐含量的影响。
2．制作果酒和果醋
(1)制作原理：许多新鲜水果(如葡萄)的果皮表面附着大量的不同种类的野生酵母菌，在它们的作用下，水果可以发酵成果酒。在有氧的条件下，果酒经醋酸菌的作用还可以进一步发酵成果醋。
(2)果酒和果醋的制作过程(以葡萄酒和葡萄醋的制作为例)
(3)结果鉴定
果酒：发酵后取样，可通过嗅味和品尝进行初步鉴定。此外，还可用显微镜观察酵母菌，并用酸性重铬酸钾检验酒精的存在。
果醋：可通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝进行初步鉴定，再通过检测和比较乙酸发酵前后的pH(可用pH试纸)做进一步的鉴定。此外，还可以通过在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量做进一步鉴定。
3．传统发酵食品的缺点
存在菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等问题，往往会造成发酵食品的品质不一。
【深入思考】
1．制作泡菜时，盐水为什么配制成质量分数为5%～20%
食盐用量过高，口味不佳，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；食盐用量过低，则会导致杂菌大量繁殖，泡菜腐败。
2．制作泡菜时，盐水为什么煮沸后冷却？
煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的微生物。冷却是为了防止杀死坛内的微生物。
3．用水密封泡菜坛的目的是什么？
给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制无氧条件。
4．泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？
不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌等。
5．为什么泡菜坛只能装八分满？
提示：防止由于产生CO2而导致发酵液溢出坛外；防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂。
6．先冲洗葡萄后去枝梗的原因？为什么冲洗葡萄的次数不能过多？
先冲洗再除去枝梗可以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。冲洗葡萄的次数不能过多，以防将葡萄皮上的野生型酵母菌冲洗掉。
7．葡萄汁装入发酵瓶时，为什么要留有大约1/3的发酵空间？
因为初期有氧呼吸阶段酵母菌需要氧气，保留1/3的体积(空气)可以为酵母菌提供氧气，使酵母菌可以大量增殖，还可以防止发酵液在发酵过程中溢出甚至引起爆炸。
8．为什么果酒搁置时间过久会有酸味？
醋酸菌在缺乏糖源时，可以将酒精转化为乙醛，再将乙醛转化为乙酸，所以果酒搁置时间过久，会因醋酸菌的代谢产生乙酸而有酸味。
【课后归纳】
1、制作泡菜的注意事项
(1)用于制作泡菜的蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的亚硝酸盐含量相对较高。
(2)控制严格的无氧条件
①选择合理的发酵容器，如泡菜坛，这是一种既科学又简单的厌氧容器。
②盐水煮沸后冷却待用。
③装坛时压实，盐水没过全部菜料。
④泡菜坛用水封口不让空气进入，创造一个封闭无氧的环境，故发酵期间不宜开盖，并注意在发酵过程中经常补水。
(3)控制适宜的发酵温度
温度过高易滋生杂菌，过低不利于乳酸发酵，会使发酵时间延长。
(4)控制发酵时间
发酵时间过短，会造成亚硝酸盐含量偏高。
2、果酒发酵与果醋发酵的比较
果酒发酵 果醋发酵
发酵菌种 酵母菌 醋酸菌
菌种来源 附着在新鲜水果果皮表面的野生酵母菌 空气中的醋酸菌或人工接种的醋酸菌
菌种代谢类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型
菌种生物类型 真核生物 原核生物
发酵原理 C6H12O62C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量 C2H5OH＋O2 CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量(缺少糖源) C6H12O6＋2O22CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量(糖源充足)
发酵条件 温度 18～30℃ 30～35℃
时间 10～12 d 7～8 d
氧气 前期需氧，后期不需氧 始终需氧
【课堂补充】
泡菜发酵过程中乳酸菌数量的变化情况
初期少：O2抑制乳酸菌活动
中期最多：乳酸抑制其他微生物活动
后期减少：乳酸积累，pH下降，抑制乳酸菌活动
泡菜发酵过程中乳酸含量的变化情况
初期少，中期增多，后期继续增多，最后保持稳定
泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化情况
初期增加：硝酸盐还原菌的作用
中期开始下降：硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解
后期继续下降：硝酸盐还原菌被完全抑制
器具消毒：防止污染发酵液
醋酸发酵：打开瓶盖，创造有氧环境进行醋酸发酵
1.2.1　微生物的基本培养技术-知识点
【基础知识】
知识点一　培养基的配制
1．实验室培养微生物的要求
(1)为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件。
(2)确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
2．培养基的概念
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3．培养基的分类
4．培养基的营养组成
(1)一般组成：水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
(2)特殊需求：满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素。
②培养霉菌时，一般需将培养基调至酸性。
③培养细菌时，一般需将培养基调至中性或弱碱性。
④培养厌氧微生物时，则需要提供无氧的条件。
易漏边角
1．微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
2．牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
知识点二　无菌技术
1．目的：获得纯净的微生物培养物。
2．关键是：防止杂菌污染。
3．主要方法
消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用 方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法、紫外线消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
适用对象 操作的空间、操作者的双手和衣着等 接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
4．特别提醒
(1)做好消毒和灭菌工作后，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(2)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
知识点三　微生物的纯培养
1．相关概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
(3)纯培养：获得纯培养物的过程。
2．微生物的纯培养步骤：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
知识点四　酵母菌的纯培养
1．原理
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
(3)获得单菌落的方法：稀释涂布平板法、平板划线法。
2．目的要求
(1)学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
(2)学会进行无菌操作。
(3)尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
3．酵母菌的纯培养的方法步骤
(1)制备培养基
①配制培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、蒸馏水。
②灭菌：培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿用干热灭菌箱灭菌。
③倒平板：待培养基冷却至50 ℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。步骤如下：
a．拔出锥形瓶的棉塞。
b．将瓶口迅速通过火焰。
c．用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基(10～20 mL)倒入培养皿，立即盖上皿盖。
d．等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
(2)接种和分离酵母菌
①方法
平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
聚集的菌群单个细胞菌落
②操作步骤
a．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
b．在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
c．将试管口通过火焰。
d．在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
e．将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
f．在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
g．灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
③注意事项
a．蘸取菌液及每次划线之前都需要灼烧接种环，划线操作结束后仍需灼烧接种环，三种灼烧的目的不同。
灼烧时期 目的
蘸取菌液前 杀死接种环上原有的微生物
每次划线前 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端
划线操作结束后 杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
b．灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
c．接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。
d．注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
e．在做第二次以及其后的划线操作时，需要从上一次划线的末端开始划线。
目的：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
f．划线后，培养皿倒置培养。
(3)培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28_℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24～48 h。
【深入思考】
1．如何通过培养基的营养组成判断微生物的同化类型？
培养基中含有机碳源培养的是异养型微生物；培养基中不含有机碳源培养的是自养型微生物。
2．为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源和氮源？
微生物的化学组成大体相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素组成，这些元素最终来自外界环境中的各种有机物和无机物。
3. 培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
4. 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
5. 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
6. 怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
将所倒平板放入适宜温度下的恒温箱中培养一定的时间，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
7．为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。
8．如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你认为是由什么原因造成的？
培养基灭菌不彻底或接种过程中有杂菌污染。
【课堂补充】
1、怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
2、培养基的营养构成
碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-（自养微生物）；有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等（异养微生物）
氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等；有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
无机盐：大量元素：Ca、K 、Mg等；微量元素：Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
3、为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
4、无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
有效避免操作者被微生物感染
5、为什么等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
6、平板划线法注意事项
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前接种环进行灭菌；
④划线后，培养皿倒置培养
【知识拓展】
1．培养基的成分
培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同，如自养型微生物的培养基不需要加入碳源。
2．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类，因为不同微生物对营养物质的需求不同。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。
(1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。
(2)整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免周围环境中微生物的污染。
(3)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
3. 几种常用灭菌和消毒方法的比较
灭菌和消毒种类 主要方法 应用范围
煮沸消毒法 100 ℃煮沸5～6 min 家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法 62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒法 紫外线照射30 min 接种室、接种箱、超净工作台
化学药物消毒法 用体积分数为70%～75%的酒精 用于皮肤、伤口、动植物组织表面、塑料或玻璃器皿等的消毒
氯气 消毒水源
灼烧灭菌 酒精灯火焰灼烧 如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱160～170 ℃维持2～3 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等
高压蒸汽灭菌(属于湿热灭菌) 100 kPa、121 ℃维持15～30 min 培养基及多种器材、物品
1.2.2　微生物的选择培养和计数-知识点
【基础知识】
知识点一　选择培养基
1．自然界中目的菌的筛选
(1)筛选的依据：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
(2)实例：从热泉中筛选出水生栖热菌。
2．实验室中微生物的筛选
(1)原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)方法：利用选择培养基筛选。
3．选择培养基
(1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
(2)选择培养基配方的设计(以筛选能分解尿素的细菌的培养基为例)
①土壤中尿素被分解的原理：土壤中某些细菌能合成脲酶，其可以催化尿素分解产生NH3，NH3再转化为NO、NH等被植物吸收，NH3还可以作为细菌生长的氮源。
培养基配方
知识点二　微生物的选择培养
1．方法
稀释涂布平板法：对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2．步骤
(1)梯度稀释
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10 g土样加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板
①取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
3．注意事项
(1)将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
(2)操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
知识点三　微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计数原则
①一般选择菌落数为30～300、适于计数的平板。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计算，然后求出平均值。
(3)结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数表示。
(4)作用：分离微生物；统计活菌数量。
2．显微镜直接计数法
(1)原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)结果：一般统计的是活菌数和死菌数的总和。
(3)优点：一种常用的、快速直观地测定微生物数量的方法。
易漏边角
细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
知识点四　实验：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．步骤
(1)培养基配方
培养基 含量 提供的营养或作用
KH2PO4 1.4 g 无机盐
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g 碳源
尿素 1.0 g 氮源
琼脂 15.0 g 凝固剂
蒸馏水 定容至1000 mL 水
(2)土壤取样
①要求：从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样。
②取样层：先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
(3)样品的稀释
①稀释倍数：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
②初次实验时，对于稀释的范围没有把握，可以选择一个比较宽的稀释范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
(4)微生物的培养与观察
①不同种类的微生物往往需要不同的培养温度和时间，细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②本实验中，我们可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。
3．注意事项
(1)要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
(2)本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
4．分解尿素的细菌的进一步鉴定
(1)鉴定原理
细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，可通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。
(2)鉴定方法
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
【深入思考】
1、能在选择培养基上生长的一定是目的菌吗？为什么？
不一定。原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。
2、如何设置对照组？
设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照。
3、如何鉴定培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？
空白对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
【课后归纳】
平板划线法和稀释涂布平板法的异同点
平板划线法 稀释涂布平板法
相同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落；接种工具都需要灭菌(无菌操作)
不同点 接种工具 接种环 涂布器
操作难易程度 操作简便 需要先进行梯度稀释，再进行涂布，操作相对繁琐
选择培养微生物的两种方法
(1)可利用分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使分离对象可大量增殖，在数量上占优势。
(2)可利用分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可大量增殖，在数量上占优势。
【课堂补充】
1、不加碳源：自养微生物；不加氮源：固氮微生物；加入青霉素：酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
；加高浓度食盐：金黄色葡萄球菌；石油是唯一碳源：能消除石油污染的微生物
2、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。
3、分离、研究土壤样品中中能分解尿素的细菌实验流程：
选择培养基的制备→对土壤样品进行稀释→涂布平板操作→培养并观察培养基菌落→计数土壤样品中菌落数目
4、取样涂布平板：一浸、二滴、三烧、四涂
5、设置两个空白对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基（以验证培养基中是否含有杂菌
）
6、选择培养基、完全培养基对照：判断选择培养基是否具有筛选作用
7、培养时设置对照组一同培养
对照组：验证是否有杂菌：未接种的选择培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
验证是否具有筛选作用：接种的牛肉膏蛋白胨培养基
8、每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M（C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数）
9、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（1）原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
（2）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强
10、测定饮水中大肠杆菌数量的方法：
将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红—美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量
1.3　发酵工程及其应用-知识点
【基础知识】
知识点一　发酵工程的概念及形成
1．发酵工程的概念：是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
2．发酵工程的形成
知识点二　发酵工程的基本环节
1．菌种的选育
(1)来源：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
(2)目的：可以加速发酵过程，缩短生产周期。
(3)实例：生产柠檬酸就需要筛选产酸量高的黑曲霉。在啤酒生产中，使用基因工程改造的啤酒酵母。
2．扩大培养
工业发酵罐的体积一般为几十立方米到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。
3．培养基的配制
在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
4．灭菌
(1)原因：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。
(2)要求：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
(3)实例：在青霉素生产过程中如果污染了杂菌，某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉。
5．发酵——发酵工程的中心环节
(1)发酵时要求：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
(2)严格控制发酵条件的原因：环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。例如，谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N 乙酰谷氨酰胺。
(3)大型发酵罐的优点：现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
6．分离、提纯产物
(1)如果发酵产品是微生物细胞本身：可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。
(2)如果发酵产品是代谢物：可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
知识点三　发酵工程的应用
1．发酵工程特点：生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等特点。
2．在食品工业上的应用
(1)生产传统的发酵产品
①意义：使这些产品的产量和质量明显提高。
②实例：酱油(霉菌)、酒类(酵母菌)。
③案例：啤酒的工业化生产流程
a．发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。
酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在主发酵阶段完成，主发酵结束后，发酵液不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，才能形成澄清、成熟的啤酒。
b．发酵的温度和发酵的时间随啤酒品种和口味要求的不同而有所差异。
c．工业化生产流程
(2)生产各种各样的食品添加剂
①食品添加剂的作用
增加食品的营养，改善食品的口味、色泽和品质，有时还可以延长食品的保存期。
②实例
添加剂类型 举例
酸度调节剂 L 苹果酸、柠檬酸、乳酸
增味剂 5′ 肌苷酸二钠、谷氨酸钠
着色剂 β－胡萝卜素、红曲黄色素
增稠剂 黄原胶、β 环状糊精、结冷胶
防腐剂 乳酸链球菌素、溶菌酶
(3)生产酶制剂
①实例：α－淀粉酶、β－淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
②酶制剂的作用
可用于食品的直接生产、改进生产工艺、简化生产过程、改善产品的品质和口味、延长食品储存期和提高产品产量等。
3．在医药工业上的应用
(1)人们可以采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。
(2)直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。例如，利用经过基因改造的微生物进行发酵生产生长激素释放抑制激素。
(3)未来甚至还可能用微生物来生产过去只能从植物中分离提取的紫杉醇、青蒿素前体等化合物。
(4)科学家还利用基因工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。例如，一种生产乙型肝炎疫苗的方法就是将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵生产。
4．在农牧业上的应用
(1)生产微生物肥料
①利用微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
②有的微生物肥料还可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。
(2)生产微生物农药
①作用原理：利用微生物或其代谢物来防治病虫害。
②实例：苏云金杆菌用来防治农林虫害；白僵菌可以防治玉米螟、松毛虫等虫害；一种放线菌产生的井冈霉素可以用于防治水稻枯纹病。
(3)生产微生物饲料
①微生物的优点：a.含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%～80%；b.生长繁殖速度很快；c.利用途径广泛。
②实例
a．单细胞蛋白：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可以作为食品添加剂；用单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
b．在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。
5．在其他方面的应用
(1)利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。
(2)嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂。
(3)嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
【课堂补充】
1、温度控制;
前期：采用稍高的温度，能促进菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速
中期：适当降低温度，延长发酵时间，提高产量
后期：提高发酵温度，刺激产物释放
2、溶解氧调控的主要手段：通风和搅拌
2.1.1　植物细胞工程的基本技术-知识点
【基础知识】
知识点一　细胞工程和细胞的全能性
1．细胞工程的含义
原理和方法 细胞生物学、分子生物学和发育生物学等
操作水平 细胞器、细胞或组织水平
目的 有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
分类 植物细胞工程和动物细胞工程(含胚胎工程)
2．细胞的全能性
(1)定义：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
(2)生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性
①原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达。
②实例：芽原基的细胞只能发育成芽，叶原基的细胞只能发育成叶。
知识点二　植物组织培养技术
1．概念：将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
2．原理：植物细胞的全能性。
3．过程
知识点三　实验：菊花的组织培养
1．实验原理
(1)植物细胞一般具有全能性。
(2)植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
(3)将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。
2．方法步骤
(1)制备外植体
①材料：幼嫩的菊花茎段。
②消毒：
③切割：将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中，用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5～1 cm长的小段。
(2)接种到诱导愈伤组织的培养基
①在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上做好标记。
②将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22 ℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
(3)接种到诱导生芽、生根的培养基
培养15～20 d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
(4)移栽
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
3．注意事项
(1)实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。
(2)接种时注意外植体的方向，不要倒插。
(3)诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。
(4)植物组织培养中两个重要激素：生长素和细胞分裂素。它们比值不同，作用不同。若生长素含量高(生长素/细胞分裂素>1)，促进根的分化；若细胞分裂素含量高(生长素/细胞分裂素<1)，促进芽的分化；若二者含量相当，促进愈伤组织的形成。
4．细胞表现全能性的条件
(1)离体状态。
(2)无菌操作。
(3)种类齐全、比例适合的营养物质。
(4)植物激素(主要是生长素和细胞分裂素)诱导和调节。
(5)适宜的外界条件(温度、pH、光照等)。
知识点四　植物体细胞杂交技术
1．概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
2．过程
(1)基本过程
(2)操作要点
①去壁：用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁，获得原生质体。
②诱导原生质体融合的方法
物理法：电融合法、离心法等。
化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。
3．原理
(1)原生质体的融合依赖于细胞膜的流动性。
(2)将杂种细胞培育成杂种植株是组织培养的过程，依赖于植物细胞的全能性。
4．意义（优点）：在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势
【深入思考】
1．理论上每种植物的活细胞都具有全能性，原因是什么？
正常的植物细胞具有发育成该物种个体所需的全部遗传物质。
2．植物的种子发育成完整植株是否体现了全能性？为什么？
否。因为种子中的胚已经完成早期发育，相当于新植株的幼体，由幼体发育成完整植株不能体现出细胞的全能性。
3．为什么融合后的杂种细胞经过筛选后才能进行植物组织培养？
提示：体细胞融合成功以后，既有AB型杂种细胞，还有AA型和BB型两种融合细胞，但只有AB型细胞是植物体细胞杂交技术所需的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。
4．植物体细胞融合与植物体细胞杂交技术结束的标志有何不同？
提示：前者是再生出细胞壁，后者是形成杂种植株。
5．为什么用酶解法去除细胞壁？
提示：酶解法是在常温下进行的，且酶具有专一性，不会影响原生质体的生命活动。
【课后归纳】
植物体细胞杂交后的遗传物质分析
(1)遗传特性：杂种植株中含有两种植物的遗传物质，故杂种植株具备两种植物的遗传特性。
(2)染色体组数
①染色体组数＝两种植物体细胞内染色体组数之和。
②植物体细胞杂交形成的杂种植株，有几个染色体组就称为几倍体。
③若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，经体细胞杂交以及组织培养形成杂种植株，则新植株应为异源四倍体，其体细胞中染色体为(2x＋2y)条，4个染色体组，基因型为AabbccDd。
【课堂补充】
1、如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖？
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花
2、细胞具有全能性原因：细胞含有该物种生长发育所特有的全套遗传物质
细胞全能性的标志：细胞 → 完整个体或其他各种细胞
全能性的高低：分化程度越高，全能性越低
受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞(精细胞、卵细胞)>体细胞；植物细胞的全能性>动物细胞全能性
3、植物组织培养技术：
生殖方式：无性生殖
分裂方式：有丝分裂
4、芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照
5、诱导愈伤组织需避光培养；诱导芽和根需适时光照培养
6、接种3-4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，试分析它们被污染的可能原因：
外植体消毒不彻底；培养基、接种工具灭菌不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等
7、植物组织培养的两种途径：
器官发生途径：
胚状体途径：
韧皮部→
8、胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但经过胚胎发育过程形成的胚状类似物
9、植物体细胞杂交技术：
基础技术：植物组织培养
变异类型：染色体数目的变异
成功标志：获得杂种植株
植物细胞融合完成的标志：获得杂种细胞（再生出细胞壁）
植物体细胞杂交技术完成的标志：获得杂种植株
2.1.2　植物细胞工程的应用-知识点
【基础知识】、
知识点一　植物繁殖的新途径
1．快速繁殖
(1)概念：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术称为植物的快速繁殖技术，也叫作微型繁殖技术。
(2)实质：植物的组织培养。
(3)特点
①高效、快速地实现种苗的大量繁殖。
②保持优良品种的遗传特性。
(4)适用对象：一些优良的观赏植物、经济林木、无性繁殖作物和濒危植物等。
(5)实例：甘蔗、桉树和铁皮石斛等试管苗的生产。
易漏边角
铁皮石斛富含某些糖类和生物碱，可以用来提取药物。
2．作物脱毒
(1)选材及原因：植物顶端分生区附近(如茎尖)的病毒极少，甚至无病毒。
(2)方法：茎尖组织培养技术。
(3)优点：脱毒作物产量和品质明显优于没有脱毒的作物。
(4)实例：马铃薯、草莓、大蒜、甘蔗、菠萝、香蕉等脱毒植株的培育。
【脱毒苗不等于抗毒苗，与微型繁殖相比较，二者无本质区别，只是取材部位不同。】
知识点二　作物新品种的培育
1．单倍体育种
(1)过程：花药(或花粉)单倍体幼苗正常植株优良品种
(2)原理：染色体数目变异、植物细胞全能性。
(3)优点
①当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。
②由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。
(4)实例
①1974年，我国科学家成功培育出世界上第一个单倍体作物新品种——单育1号烟草。
②把单倍体育种与常规育种结合起来，育成了水稻、玉米、油菜和甜椒等作物的新品种。
2．突变体的利用
(1)过程：在植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响而产生突变。从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。
(2)原理：突变和植物细胞的全能性。
(3)实例：抗病、抗盐、高产以及蛋白质含量高的突变体，有些品种已经用于生产，如抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草等
知识点三　细胞产物的工厂化生产
1．次生代谢物
(1)含义：植物代谢会产生一些一般认为不是植物基本的生命活动所必需的产物——次生代谢物。
(2)本质：小分子有机化合物(如酚类、萜类和含氮化合物等)。
(3)作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。
易漏边角
初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，因此在整个生命过程中它一直进行着。初生代谢物有糖类、脂质、蛋白质和核酸等。次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。
2．细胞产物的工厂化生产
(1)定义：利用植物细胞培养来获得目标产物的过程就是细胞产物的工厂化生产。
(2)植物细胞培养：指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。
(3)优点：它不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。
(4)实例：紫草宁、紫杉醇、人参皂苷
【深入思考】
1．快速繁殖是无性生殖吗？
快速繁殖实际是一种无性生殖，繁殖过程中细胞的分裂方式是有丝分裂，亲、子代细胞内遗传物质相同，因此能保证亲、子代遗传特性不变。
2．为何植物分生区附近病毒少？
植物分生区附近，细胞分裂十分迅速，病毒来不及侵入，因此就成为植物体相对无病毒的特殊区域。
4．单倍体育种中为何要进行人工诱导染色体加倍？常用的诱导方法是什么？
单倍体植株弱小，高度不育。通常用秋水仙素或低温处理单倍体幼苗，诱导其染色体加倍。
5．二倍体的单倍体育种和花药离体培养获得的植株有什么区别？
花药离体培养得到的植株是单倍体，表现为高度不育；单倍体育种是在花药离体培养的基础上，用适当浓度的秋水仙素或低温处理，获得纯合的二倍体植株是可育的
6、单倍体育种与多倍体育种的异同。
单倍体育种和多倍体育种均需要用秋水仙素或低温诱导染色体数目加倍。单倍体育种需要植物组织培养先形成单倍体幼苗，但多倍体育种一般不使用植物组织培养技术
【课后归纳】
1、四种生物技术的比较
项目 植物组织培养 突变体的利用 单倍体育种 植物体细胞杂交
原理 植物细胞的全能性 突变、植物细胞的全能性 花粉细胞的全能性、染色体数目变异 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
重要步骤 脱分化、再分化 对愈伤组织诱变处理 花药离体培养、秋水仙素或低温诱导染色体数目加倍 原生质体融合、杂种细胞组织培养
优点 保持优良品种的遗传特性 提高突变率，获得优良性状 明显缩短育种年限 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
举例 微型繁殖、脱毒苗培育、人工种子培育 抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草 单育1号烟草 培育“番茄—马铃薯”杂种植株
2、植物组织培养与植物细胞培养的比较
项目 植物组织培养 植物细胞培养
目的 获得植物体 获得细胞产物
培养基 固体培养基 液体培养基
实例 脱毒苗 人参皂苷的生产
【课堂补充】
1、
① 一般组织培养到愈伤组织即可（因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。）
②液体培养基（培养液）有利于培养的细胞与营养物质充分接触
2.2.1动物细胞培养-知识点
【基础知识】
知识点一　动物细胞工程
1．常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等。
2．基础：动物细胞培养。
知识点二　动物细胞培养
1．概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2．地位：动物细胞工程的基础。
3．条件
(1)营养
①细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，例如，糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。
②将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
(2)无菌、无毒的环境
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
②在无菌环境下进行操作。
③还需要定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
(3)温度、pH和渗透压
①适宜温度：哺乳动物细胞培养的温度多以 (36.5±0.5) ℃为宜。
②适宜pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
③适宜渗透压：维持适宜渗透压的目的是维持细胞正常的形态和功能。
(4)气体环境
①组成
动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
②不同气体的作用
O2是细胞代谢所必需的；CO2的主要作用是维持培养液的pH。
③培养容器
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
④培养仪器
含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。
4．基本过程
5．注意事项
(1)将动物组织分散成单个细胞的方法
(2)原代培养
①具体做法
将组织分散成单个细胞，用培养液将细胞制成细胞悬液，将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内。
②体外培养细胞的两大类
a．能够悬浮在培养液中生长增殖。
b．需要贴附于某些基质表面才能生长增殖(大多数细胞)。
(3)分瓶、传代培养
①需分瓶进行传代培养的原因
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。
②分瓶的具体做法
a．悬浮生长类
直接用离心法收集之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
b．贴壁生长类
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
(4)重要名词解释
①原代培养
通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
②传代培养
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
③细胞贴壁
大多数体外培养的细胞需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
④接触抑制
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
知识点三　干细胞培养及其应用
1．存在场所：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
2．类型
(1)胚胎干细胞(简称ES细胞)
①定义：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
②应用：ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。
(2)成体干细胞
①定义：是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。
②特点：有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
③发现最早、研究最多、应用也最为成熟的实例：造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
3．应用
(1)与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用
①将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。
②神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)方面有重要的应用价值。
(2)诱导多能干细胞(简称iPS细胞)
①最初是经体外诱导小鼠成纤维细胞获得的，并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
②现在，用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
③iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
易漏边角
科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。
【深入思考】
1．如何防止培养过程中的微生物污染？
在细胞培养液中添加一定量的抗生素。
2．培养前为什么要将动物组织分散成单个细胞？
分散后细胞能与培养液充分接触，更易进行物质交换；且成块的组织中细胞靠在一起限制了彼此的生长和增殖。
3．动物细胞培养过程中，用胰蛋白酶处理的时间是不是越长越好？可不可以用胃蛋白酶处理？
不是。时间过长胰蛋白酶会催化分解细胞膜蛋白等，对细胞有损伤。不可以。由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，而胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5，当pH大于6时，胃蛋白酶会失去活性。
4．如何打破接触抑制呢？癌细胞存在接触抑制吗？
贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。癌细胞增殖时不存在接触抑制，在培养瓶中可以形成多层细胞。
5．动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？
未体现，因为动物细胞培养只是细胞增殖的过程。
【课后归纳】
1、动物细胞培养和植物组织培养的比较
植物组织培养 动物细胞培养
原理 植物细胞的全能性 细胞增殖
培养前处理 离体 用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
取材 离体植物器官、组织、细胞 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
培养基的物理性质 固体 液体(又称培养液)
培养基的成分 有机营养成分、无机营养成分、植物激素 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
特有成分 植物激素 血清
特殊环境条件 再分化需光 气体环境
结果 一般获得新的植株 获得大量细胞
是否体现细胞的全能性 是 否
过程
相同点 1．培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂； 2．均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
【课堂补充】
2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体-知识点
【基础知识】
知识点一　动物细胞融合技术
1．概念：就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2．结果：融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
3．原理：细胞膜的流动性。
4．诱导方法
常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
5．意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
6．应用：是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
易漏边角
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
知识点二　单克隆抗体及其应用
1．B淋巴细胞的特点：每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，但在体外培养条件下，不能无限增殖。
2．单克隆抗体制备的思路
把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。
3．制备过程
(1)基本过程
(2)过程分析
①该过程中应用到的技术：动物细胞融合、动物细胞培养。
②原理：细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖。
③注射特定抗原的目的：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
④诱导融合的方法：PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法。动物细胞特有的为灭活病毒诱导法。
⑤第一次筛选的目的：筛选获得杂交瘤细胞。
⑥第一次如何筛选：用特定的选择培养基进行筛选。
⑦筛选原理：在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
⑧杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体。
⑨第二次筛选：对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
⑩选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即分泌的抗体能与特定的抗原结合。
4．单克隆抗体的优点
(1)能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。
(2)可以大量制备。
5．应用
(1)作为诊断试剂
广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物
抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成。
(3)治疗疾病
在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
【深入思考】
1．动、植物细胞融合时，所用诱导方法有何不同？
动物细胞可用灭活的病毒进行诱导；植物细胞可以采用高Ca2＋—高pH融合法。
2．不灭活的病毒能否作为诱导剂？
不能。用病毒作为诱导剂时，必须事先灭活使病毒失去感染和增殖能力，但不破坏病毒的抗原结构。而不灭活的病毒会感染细胞，不能诱导细胞融合。
3. 血清抗体与单克隆抗体有什么区别？
①血清抗体：由B淋巴细胞(浆细胞)分泌，产量低、种类多、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。②单克隆抗体：由杂交瘤细胞分泌，化学性质单一、特异性强、反应灵敏、可大量制备。
【课后归纳】
1、动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术的比较
动物细胞融合技术 植物体细胞杂交技术
原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、细胞的全能性
细胞融合前的处理方法 用机械方法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等使组织分散成单个细胞 用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
诱导手段 物理法：电融合法 化学法：聚乙二醇(PEG)融合法 生物法：灭活病毒诱导法 物理法：离心法、电融合法 化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法
诱导过程
用途 制备单克隆抗体 培育新品种
意义 使远缘杂交成为可能 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
2、细胞融合过程中，有同种细胞间的融合和不同种细胞间的融合，还有未融合的细胞。
3、单克隆抗体的制备与动物细胞融合相比，其原理不仅包括细胞膜的流动性，还包括细胞增殖。
4、能产生特定抗体的杂交瘤细胞在小鼠腹腔内培养与体外培养相比的优点是不需特定的培养基，不需严格的外界环境条件。
【课堂补充】
2.2.3 动物体细胞核移植技术和克隆动物-知识点
【基础知识】
1．动物细胞核移植技术概念：是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。该个体不经过有性生殖过程，其遗传物质与细胞核供体基本相同，叫作克隆动物。
易漏边角
减数分裂Ⅱ中期(MⅡ期)卵母细胞中的“核”其实是纺锤体——染色体复合物。文中所说的“去核”是去除该复合物。
2．理论基础：动物细胞核的全能性。
3．生殖方式：无性生殖。
4．分类
(1)胚胎细胞核移植
动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易。
(2)体细胞核移植
动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。
5．非人灵长类动物体细胞核移植困难的原因
(1)供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低。
(2)对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。
6．动物体细胞核移植的过程
(1)该过程中应用到的技术
动物细胞核移植技术、动物细胞培养技术、动物细胞融合技术、胚胎移植技术。
(2)激活重构胚的方法：电刺激、Ca2＋载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等。
(3)激活重构胚的目的
使其完成细胞分裂和发育进程。
(4)实验结论
证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。
易漏边角
重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。
7．动物体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
应用前景 畜牧生产 加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育
保护濒危物种 有望增加濒危物种的存活数量
医药卫生 转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白 治疗人类疾病： ①转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植。 ②以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反应
科研 ①研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程。 ②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因。 ③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助
存在的问题 ①成功率非常低，各个技术环节有待进一步改进。 ②相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后。 ③绝大多数克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷
【深入思考】
1．受体细胞去核的原因是什么？
受体细胞去核可以保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞。
2．选取MⅡ期的卵母细胞作为受体细胞的原因是什么？
①卵母细胞细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。
②卵母细胞体积大，便于操作。
③卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富。
3．克隆动物的特点及各特点的原因是什么？
①基因型与核供体完全相同。
原因：克隆动物的细胞核遗传物质全部来自核供体。
②性状与供体基本相同。
原因：a．克隆动物的大部分性状受细胞核控制，而细胞核来自核供体；
b．克隆动物的细胞质遗传物质来自卵母细胞的细胞质；
c．生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境影响。
【课后归纳】
对克隆的理解
(1)概念：是指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。
(2)克隆的不同层次
①分子水平：如PCR技术扩增DNA、DNA的复制。
②细胞水平：如动物细胞培养、细胞分裂。
③器官水平：利用干细胞培养一个新器官。
④个体水平：如“多莉”羊的诞生、扦插枝条形成植物体、植物组织培养形成植物体。
【课堂补充】
1、克隆动物不是核供体动物100%复制的原因是什么？
①克隆动物的细胞质遗传物质来自受体卵母细胞的细胞质
②生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境等因素的影响
2、供体细胞的选择：一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础
3、卵母细胞去核的方法：显微操作去核法
4、
5、在将体细胞的核移植到卵母细胞之前，为什么必须对卵母细胞进行去核操作？
为了使核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞
2.3.1胚胎工程的理论基础-知识点
【基础知识】
知识点一　胚胎工程
1．概念：指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
2．技术手段：体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。
知识点二　受精
1．概念：受精是精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。
2．场所：雌性的输卵管。
3．过程：包括受精前的准备阶段和受精阶段。
4．准备阶段
(1)准备阶段1——精子获能
①概念：刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一生理现象称为“精子获能”。
②研究精子获能机制的意义：实现了各种哺乳动物精子在体外条件下的获能，为体外受精技术的建立奠定了基础。
③成熟精子结构：头、颈、线粒体鞘、尾。
易漏边角
使精子获能的方法
①直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；
②将精子培养在人工配制的获能液中使其获能等。
获能液的成分因动物种类不同而有所差异，常见的有效成分有肝素、Ca2＋载体等。
(2)准备阶段2——卵子的准备
①卵子一般在排出2～3 h后才能被精子穿入。
②动物排出的卵子成熟程度不同
有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；
有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。
③卵子成熟的场所
排出的卵子都要在输卵管内进一步成熟。
④卵子具备与精子受精能力的时期为MⅡ期。
⑤具备受精能力的卵子结构。
5．受精阶段
过程 主要变化
精子穿越卵细胞膜外的结构，接触卵细胞膜 获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放多种酶，以溶解卵细胞膜外一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透明带会迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带(透明带反应：防止多精入卵的第一道屏障)
精子入卵 精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内(卵细胞膜反应：防止多精入卵的第二道屏障)
形成雄、雌原核 精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，形成雄原核；同时卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核
受精卵形成 雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵
易漏边角
多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ，因而不会形成两个第二极体。在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。
知识点三　胚胎早期发育
1．起点：受精卵。
2．开始发育场所：输卵管。
3．分裂方式：有丝分裂。
4．卵裂
(1)概念：受精卵的早期分裂。
(2)场所：透明带。
(3)特点
①细胞数量不断增加；
②胚胎总体积并不增加。
5．早期发育的胚胎各阶段及特点
(1)桑葚胚：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。
(2)囊胚
①概念
胚胎进一步发育，细胞逐渐分化，形成内细胞团、滋养层；随着胚胎进一步发育，胚胎内部出现了含有液体的腔——囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。
②结构组成
③孵化：囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来。
易漏边角
囊胚孵化后，将发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行，一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。
【课后归纳】
(1)个体发育的过程包括胚胎发育和胚后发育，胚胎发育的起点是受精卵，终点是成熟的胎儿；胎儿出生后的发育过程属于胚后发育。因此，个体发育的起点是受精卵，终点是性成熟的个体。
(2)受精卵是新生命的第一个细胞，其全能性最高。细胞全能性随发育的深化而降低。
(3)桑葚胚阶段及之前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。
(4)桑葚胚进一步发育，细胞开始出现分化，并逐渐形成囊胚，囊胚阶段细胞的全能性仍然很高。
胚胎发育早期细胞或物质的变化规律
细胞数目：增多：所有细胞总体积：不增加；每个细胞体积：减小；核DNA总量：增多；每个细胞内的核DNA含量：不变；有机物总量：减少；物质种类：增多；所含能量：减少
【课堂补充】
1、精子的头部主要是细胞核，线粒体鞘为精子的运动提供能量
2、
2.3.2胚胎工程技术及其应用-知识点
【基础知识】
知识点一　体外受精
1．试管动物含义：通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。
2．体外受精
(1)主要包括：卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理，之后再将二者置于适当的培养液中共同培养一段时间，促使其完成受精。
(2)哺乳动物体外受精过程
(3)意义：是提高动物繁殖能力的有效措施，还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。
知识点二　胚胎移植
1．胚胎移植的概念
通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
2．胚胎移植的供体及受体
(1)供体
①定义：在胚胎移植中提供胚胎的个体。
②供体选择标准：遗传性状优良、生产能力强。
③供体职能：产生具有优良遗传特性的胚胎。
(2)受体
①定义：在胚胎移植中接受胚胎的个体。
②受体选择标准：有健康体质和正常繁殖能力。
③受体职能：承担繁重而漫长的妊娠和育仔任务。
3．胚胎移植的基本程序(以牛的胚胎移植为例)
供体、受体的选择和处理→配种或人工授精→胚胎的收集、检查、培养或保存→胚胎的移植→移植后的检查。
4．牛胚胎移植的过程
易漏边角
超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。
5．胚胎移植的优势
(1)充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
(2)大大缩短了供体本身的繁殖周期。
(3)对供体施行超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，增加供体一生繁殖后代的数量。
6．地位：胚胎移植作为胚胎工程的最终技术环节，还将推动胚胎工程其他技术的研究和应用。
7．胚胎移植的生理学基础
生理学基础 意义
同种动物的供、受体排卵后，生殖器官的生理变化是相同的 为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境
早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态 为胚胎的收集提供了可能
受体对外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应 为胚胎在受体内存活提供了可能
供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但其遗传特性不受影响 为移植后的胚胎继续发育提供了营养等方面的保障
8．胚胎移植的实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
知识点三　胚胎分割
1．概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
2．实质：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。
3．仪器设备：体视显微镜和显微操作仪。
4．操作程序
(1)选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中。
(2)在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。此时还可用分割针在滋养层处取样，做DNA分析，鉴定性别。
注：对于不同发育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。
(3)分割后的胚胎可以直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。
5．意义
(1)可以促进优良动物品种的繁殖，产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。
(2)胚胎移植前，进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。
【深入思考】
1．在胚胎移植操作中，怎样才能使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致？原因是什么？
对供体和受体母畜进行同期发情处理。同期发情处理使供、受体排卵后，生殖器官的生理变化相同，为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境。
2．胚胎移植中胚胎来源有哪些？生殖方式是什么？
①动物体细胞核移植——无性繁殖。②体外受精——有性生殖。③体内受精——有性生殖。④转基因受精卵——有性生殖。
3．为什么同种动物之间进行胚胎移植易于成功？
这里的“同种”是指“同物种”，同一物种的动物才有可能具有相同的生理特征。
4．胚胎移植的后代具有供体和受体共同的遗传性状吗？性别由谁决定？
不具有。后代的遗传性状是由供体决定的，受体只是提供了胚胎发育的场所，不影响后代的遗传特性；性别取决于公牛提供何种精子。
5．为什么选择桑葚胚或囊胚进行胚胎分割？
①桑葚胚阶段及之前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。②桑葚胚进一步发育，细胞开始分化，逐渐形成囊胚，囊胚阶段的细胞全能性仍然很高，可用于胚胎分割。
6．对囊胚阶段的胚胎分割时，为什么将内细胞团均等分割？
若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。
7．做性别鉴定时，为什么取滋养层细胞？
取滋养层细胞不影响胚胎分割和发育。
8．胚胎分割是不是分割的份数越多，效率越高？
分割的份数越多，技术难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低。
【课后归纳】
人工授精和体外受精的比较
比较项目 人工授精 体外受精
概念 人工授精技术是指用相应的器械采集公畜的精液，再将其注入正在发情的母畜的生殖道中，使母畜受孕的过程 体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术
场所 母畜的生殖道内 体外
过程 人工采精→检查与储存精液→人工授精(用人工的方法将精液注入正在发情的母畜生殖道中) →
胚胎发育场所 受精卵的形成和胚胎发育场所在母畜体内 受精卵的形成和早期胚胎发育在体外，胚胎移植后的胚胎发育在母畜体内
胚胎移植的三点提醒
(1)“移植的胚胎在受体内存活的基础条件”是指受体对外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
(2)哺乳动物发情排卵后，不管雌性动物妊娠与否，都会产生黄体，并维持一段时间，称为黄体期。在这段时间里，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。
(3)胚胎移植涉及牛的种类及作用
供体配种
受体母牛：提供子宫
【课堂补充】
1、精子离心处理的目的：精液由精子和精清两部分组成。精清中含有一种能抑制精子获能的物质，精子获能前进行离心处理，目的是除去精清以利于精子获能。
2、什么是同期发情处理？
利用某些激素人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。
3、超数排卵：用促性腺激素处理供体母牛，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子
4、胚胎的收集：用特制的冲卵装置，把供体母牛子宮内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵
冲卵：是指用配制好的冲卵液，借助特制的冲卵装置，将供体母畜子宫或输卵管中的胚胎冲洗出来
5、胚胎的检查：胚胎应该发育到桑葚胚或囊胚阶段。
6、将收集的胚胎直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存
7、胚胎移植后，经受体孕育的后代，其遗传特性与供体保持一致的原因：供体胚胎与受体子宫建立的仅是生理和组织上的联系，其遗传物质在孕育过程中不会发生任何变化。
3.1重组DNA技术的基本工具-知识点
【基础知识】
知识点一　基因工程概念及工具
1．基因工程概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自原核生物。
(2)种类：数千种。
(3)作用
①识别：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列。
②切割：使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(4)识别序列特点
大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(5)结果：产生黏性末端或平末端。
①一个限制酶切割一次断开两个磷酸二酯键形成两个末端。
②同一种限制酶切割形成的末端相同。
③两个末端有2个游离的磷酸基团。
3．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)DNA连接酶种类
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能特性 只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来 “缝合”两种末端，但连接平末端的效率相对较低
相同点 都恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，如图：
4．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用
①将目的基因运输到受体细胞中去。
②使目的基因能够在受体细胞内进行大量复制。
(2)种类
①常用载体：质粒。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
②其他载体：噬菌体、动植物病毒等。
(3)质粒
①定义：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②质粒作为载体所具备的条件
a．有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。
b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c．常有特殊的标记基因，以便重组DNA分子的筛选，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等。
知识点二　DNA的粗提取与鉴定
1．提取DNA的思路
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
2．提取DNA的原理
(1)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
3．鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
4．材料用具
(1)选材
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
(2)试剂
①研磨液。
②体积分数为95%的酒精，作用：析出DNA。
③2 mol/L的NaCl溶液，作用：溶解DNA。
④二苯胺试剂，作用：鉴定DNA。要现配现用。
⑤蒸馏水。
5．实验步骤(以洋葱为例)
(1)取材和研磨
称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
(2)过滤或离心取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液放入烧杯中。
(3)预冷酒精析出DNA并收集DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(4)NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。6．结果：加入沉淀物或丝状物的试管中溶液变成蓝色。
【深入思考】
1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
①有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；②基因工程可以在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
2．原核生物体内的限制酶不切割自身DNA的原因？
原核生物的DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3．病毒为什么可以作为基因工程的载体？
因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以病毒也可作为基因工程的载体。
4．可否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？
不可以。哺乳动物成熟的红细胞内没有细胞核和各种复杂的细胞器，不含有DNA。
5．提纯时，为什么要选用体积分数为95%的冷酒精？
预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
【课后归纳】
几种酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子解旋为单链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生的：一看游离碱基能否相互配对；二看两条链上的切点是否相同。
技巧：将两个黏性末端摆成同样的形状，若完全相同，则说明这两个黏性末端是由同一种限制酶切割产生的
【课堂补充】
1、为什么需要载体？
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子
2、形成一个重组质粒会形成四个磷酸二酯键
3、DNA的粗提取与鉴定：DNA纯度——看提取物颜色；DNA的量——看与二苯胺反应颜色的深浅
4、提取DNA时为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA
3.2 基因工程的基本操作程序-知识点
【基础知识】
知识点一　基因工程操作的基本程序
1．目的基因的筛选与获取。
2．基因表达载体的构建。
3．将目的基因导入受体细胞。
4．目的基因的检测与鉴定。
知识点二　目的基因的筛选与获取
1．目的基因概念
基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
2．筛选合适的目的基因
(1)方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)实例：苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关，通过对Bt基因的序列信息还有Bt抗虫蛋白的研究，选择Bt基因作转基因抗虫棉的目的基因。
3．获取目的基因的具体方法：人工合成；利用PCR技术获取和扩增；构建基因文库等。
4．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR概念
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)PCR条件
①原料：4种脱氧核苷酸。
②模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。
③酶：耐高温的DNA聚合酶。
④引物：2种，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
⑤其他条件：需要一定的缓冲溶液和能够自动调节温度的温控设备等。
易漏边角
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
(3)PCR过程
①变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
②复性：当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④结果：由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
(4)反应仪器：PCR扩增仪(PCR仪)。
(5)产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳。
5．拓展
(1)两种引物都结合在DNA模板链的3′端，脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
(2)①n代后，DNA分子有2n个。
②n代后，DNA链有2n＋1条。
③n代后，含引物的DNA分子有2n个。
④n代后，共消耗了2n＋1－2个引物。
⑤第n代复制，消耗了2n个引物。
知识点三　基因表达载体的构建
1．重要性：基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心工作。
2．操作目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
3．组成
4．构建过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段；再用DNA连接酶把两者连接(如图)。
知识点四　将目的基因导入受体细胞
1．将目的基因导入植物细胞
(1)方法：花粉管通道法——我国独创的方法。
(2)实例：将Bt基因导入棉花细胞。
(3)操作方式：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
(4)受体细胞：受精卵或体细胞。
易漏边角
农杆菌转化法
(1)转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)农杆菌特点：①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(3)农杆菌转化法的过程
将目的基因插入Ti质粒的T DNA中，将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
2．将目的基因导入动物受精卵
(1)方法：显微注射技术，最常用的方法。
(2)受体细胞：受精卵。
(3)结果：这个受精卵将发育成具有新性状的动物。
3．将目的基因导入微生物细胞
(1)受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。
(2)方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
知识点五　目的基因的检测与鉴定
1．操作目的：目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道，这是检查基因工程是否成功的一步。
2．目的基因检测与鉴定的方法
类型 检测内容 方法
分子水平的检测 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术
检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交技术
个体生物学水平的鉴定 检测表达产物是否具有生物学活性(或生物个体是否具有相应性状) 接种实验
知识点六　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR仪
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
2．电泳鉴定PCR产物的原理
(1)电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(2)鉴定方法
PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(3)鉴定原理
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
3．实验操作
(1)用微量移液器在微量离心管中依次加入PCR反应体系配方的各组分。
(2)待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
(3)设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
(4)根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
(5)将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
(6)待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
(7)将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
(8)将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(9)接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(10)取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
4．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
【深入思考】
1．PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
2．DNA复制时为什么需要引物？
在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
3．PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？
不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同的。
4．延伸过程是否需要ATP供能？
不需要。
6．用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，可能有几种产物？
三种：载体—载体、目的基因—目的基因、载体—目的基因。
7．用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的“载体—目的基因”产物一定符合要求吗？
不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。
8．如何避免上述(1、2题)问题？
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体(使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同)。
9．将生物的所有DNA直接导入受体细胞效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
10．目的基因插入载体的位置是随机的吗？
目的基因插入载体的位置不是随机的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能，同时也不能插入标记基因中，否则会使标记基因被破坏无法进行筛选。
11．植物基因工程常用的受体细胞为什么是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中

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