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3.2 基因工程的基本操作程序
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
1.转化
2.转化的受体细胞
03
将目的基因导入受体细胞
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
基因枪法
花粉管
1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
受体细胞：受精卵
地位：我国科学家独创
实例：将Bt基因导入棉花细胞
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法
①农杆菌的特点
农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②转化原理
③过程：
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
④农杆菌转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
体细胞
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受精卵
受体细胞为？
受体细胞为？
【说明】随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
④农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
a.两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上；
第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞 上。
b.两次导入：
第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入 ；
第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的 导入受体细胞。
T —DNA
染色体DNA
T —DNA
农杆菌
适用于单子叶植物
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
3.将目的基因导入到植物细胞中方法--基因枪法
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。
4.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
（1）受体细胞：
受精卵
受精卵容易表现出全能性
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的转基因动物
①受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
5.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时。
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
以上情况如何解决？
以上情况如何解决？
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
04
目的基因的检测与鉴定
1.目的
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
第二步 目的基因是否转录出mRNA
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质
个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 2.检测内容及方法
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA半保留复制
原理：
分子水平的检测
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
电泳操作
方法2：DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
一段带放射性或荧光标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
基因探针：
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
Bt基因在抗虫棉中的表达
从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原抗体的特异性结合
原理：
抗原-抗体杂交技术
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
个体水平的鉴定
(1) 的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行 。
抗虫或抗病
活性比较
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
小结：

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