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专题2 微生物的培养技术与应用
回顾旧知
微生物
概念：难以用肉眼观察的微小生物的统称
分类：
真核细胞
原核细胞
无细胞结构
细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
RNA病毒:SARS病毒、新冠病毒等；
DNA病毒：噬菌体等
真菌:酵母菌、毛霉等；
原生生物:草履虫、变形虫等
1.微生物的类群
原核生物 (细菌、蓝细菌等)
原生生物 (如草履虫、衣藻等)
真菌 (如酵母菌、霉菌等)
酵母菌
青霉菌
大型真菌
球菌
蓝细菌
放线菌
草履虫
衣藻
病毒（无细胞结构）
禽流感病毒
SARS病毒
思考：你知道什么是微生物？哪些生物属于微生物吗？
（难以用肉眼观察的微小生物的统称）
真核生物
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。
一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术
微生物的基本培养技术
1._____________________________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
2.在实验室培养微生物的要求:
①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
培养基
无菌技术
高压蒸汽灭菌
1.何为培养基？
3.不同的培养基有不同的配方，但是其基本成分都相同，都包括哪些营养构成？有何作用？请举例说明。
阅读教材P9~10相关内容，回答以下问题：
2.按照不同的划分标准，培养基有哪些类型及用途？
一、培养基的配制：
培养基（培养液）是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
1.培养基的概念
1.基本成分：
水、无机盐、碳源、氮源、
（1）碳源：能微生物提供所需碳元素的营养物质
作用：构成微生物体细胞的物质和一些代谢产物
有些有机碳源是异养微生物的主要能源物质。
分类：
无机碳源：
有机碳源：
CO2、CO32-、
HCO3-
葡萄糖、牛肉膏、
蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
⑵氮源：能微生物提供所需氮元素的营养物质
分类：
无机氮源：
有机氮源：
N2、NH3、铵盐、硝酸盐等
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、
尿素等
作用：培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
旁栏思考题：
为什么培养基需要氮源？
请判断下列说法的正确性
1、同一种物质不能既做碳源，又做氮源。
2、碳源都能提供能量。
3、NaHCO3只能提供碳源。
4、无机氮源也能提供能量。
牛肉膏提供 ， 蛋白胨提供 ， 纤维素提供 ，尿素提供 。
碳源、氮源
碳源、氮源
碳源
氮源
√
×
×
×
注：（1）含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
（2）NH3既是硝化细菌的氮源，又是能源；N2是固氮菌的氮源。
（3）自养型与异养型生物划分主要是依据能否
以CO2作为生长的主要或唯一碳源。
（4）无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。
2、培养基的特殊需求
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对___、____________以及___的需求；
pH
特殊营养物质
O2
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
添加维生素
调至酸性
调至中性或弱碱性
提供无氧的条件
下列四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，正确的是( )
A.硝化细菌 B.乳酸菌
C.酵母菌 D.衣藻
硝化细菌 乳酸菌 酵母菌 衣藻
能源 氧化NH3 分解乳酸 固定N2 利用光能
碳源 CO2 糖类 糖类 CO2
氮源 NH3 N2 N2 NO3-
代谢类型 自养 需氧型 异养 需氧型 异养 需氧型 自养
需氧型
A
（1）按物理状态分：
（2）按功能分：
（3）按成分分：
2.培养基的类型
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
天然培养基
合成培养基
种类 是否含凝固剂（如琼脂） 用途
固体培养基
半固体培养基
液体培养基
按物理性质分
是
（1.5%-2.5%）
是
（0.2%-0.7%）
否
分离、计数、鉴定、菌种的保藏等
观察微生物的运动、
鉴定菌种等
工业生产
注意说明
1.加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
2.微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落
3.扩大培养获得大量菌种时，常用液体培养基。
在适宜的固体培养基表面或内部由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单个
或少数菌体
2.特征：
大小、形状、光泽度、
颜色、透明度等。
3.功能：
1.定义：
菌落
鉴定菌种的重要依据
固体培养基上
大量繁殖
子细胞群体
按培养基的功能（用途）分
种类 特 点 用途
选择培养基
鉴别培养基
根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，只允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长
培养、分离特定
微生物
选择培养基实例
①加入青霉素可以分离出________________。
②加入高浓度的食盐可得到_________________。
③缺乏氮源时，可以分离____________。
④某种营养成分为特定化学成分时，如尿素是唯一氮源时，分离___________。
⑤改变微生物的培养条件，如将培养基放在高温环境中培养只能得到_________________。
⑥不加含碳有机物的无碳培养基，分离________________
酵母菌和霉菌
金黄色葡萄球菌
固氮微生物
分解尿素菌
耐高温的微生物
自养型微生物
按培养基的功能（用途）分
种类 特 点 用途
选择培养基
鉴别培养基
培养基加入某种化学物质，只允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长
鉴别不同种
类的微生物
根据微生物的代谢特点，
在培养基中加入某种
指示剂或化学药品
培养、分离特定
微生物
刚果红——纤维素分解菌
挑选产生透明圈的菌落
鉴别培养基实例
刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。
伊红-美蓝——大肠杆菌
大肠杆菌菌落呈黑色
按化学成分分
种类 化学成分是否明确 用途
天然培养基 （如马铃薯、玉米粉等）
合成培养基 （化学药品）
否
是
主要用于
工业生产
分离、鉴定、
计数
（1）左表培养基可培养的微生物类型是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中，如不想浪费此培养基，可再加入 ，
用于培养 。
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
下表是某微生物培养基成分，请据此回答：


自养型微生物
含碳有机物
金黄色葡萄球菌
固氮微生物
3
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（6）表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
调整PH
琼脂
依微生物的生长需要确定
补充说明：
① 含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。
② 自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。
③ 自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。
④ 无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。
⑤ 无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。
二、无菌技术
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。
清洁和消毒
获得纯净培养物的关键是 。
防止外来杂菌污染
：消毒和灭菌
灭菌
（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。
（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
酒精灯火焰
　（１）消毒定义：
利用较为温和的化学或物理方法杀死物体表面或内部的部分微生物的过程。不包括芽孢和孢子。
消毒与灭菌的概念及两者的区别
（2）灭菌的定义：
以强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，
包括芽孢和孢子。
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源
4、紫外线30min消毒，照射前，可喷石炭酸或煤酚皂等消毒液加强消毒效果
(1)消毒的方法：
常用的消毒方法
1、灼烧灭菌：
接种环、接种针、试管口、瓶口
灭菌的方法：
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层
2、干热灭菌：
玻璃器皿和金属用具
3、高压蒸汽灭菌：
160-170 ℃下加热1-2h。
100kPa、121 ℃
下维持15-30min
1.取桶加水
（二）高压蒸汽灭菌的操作方法
将内层灭菌桶取出，向外层锅内加水，水面与
三角形搁架平齐。
2.装入待灭菌的物品
注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通影响
灭菌效果。
3.加盖,拧紧螺栓
加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的
排气槽内。
拧紧固定盖子的螺栓，注意要同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，不漏气。
4.加热灭菌
加热灭菌锅，打开排气阀，等冷空气完全
排尽后，关闭排气阀。100kPa、温度
121℃下，保温保压20~30min。
切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，压力表降到
“0”点，温度下降后，打开排气阀，旋开固定
螺栓，取出灭菌物品。
5.降温取物
判断下列叙述是否正确。
A、加水时，水面应与三角搁架平齐
B、高压蒸汽灭菌加盖时应按顺时针方向依次
旋紧螺栓
C、高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使
压力表指针回到零后，开启锅盖
D、 加盖时，将排气软管插入内层灭菌桶的排气槽
内
E、 加热时，待冷空气完全排尽后关上排气阀
√
×
×
√
√
请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
思考
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1.计算：（根据微生物生长时对营养物质的需求）
物质 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
重量 5g 10g 5g 20g 定溶至1000mL
三、实验操作
思考：该培养基从物理性质分属于哪种？原因？含有几种营养成分？牛肉膏提供上述哪几种成分？
2.称量
准确称取各种成分。
注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。
3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，不断用玻璃棒搅拌，原因：防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。待溶解后，加自来水定溶至100mL。（熔化后灭菌前应该调节PH)
4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压蒸汽灭菌锅内灭菌。培养皿（3～5套，用几层报纸包好）放入干热灭菌箱灭菌。
三.大肠杆菌的纯化培养：
㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算
称量
溶化
调pH、分装、封口
灭菌
倒平板
→
→
→
→
→
5.倒平板：待培养基冷却到50℃左右时倒平板。
①在酒精灯火焰旁操作，
右手拿装有培养基的锥形瓶，
左手拔出棉塞。
②锥形瓶的瓶口要迅速通过火焰。
③左手将培养皿打开一条稍大于
瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中培
养基倒入培养皿，左手立即盖上
培养皿的皿盖。
④待培养基凝固，将平板倒置，使皿盖在下，皿底在上。
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
问题讨论
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可以避免培养基表面的水分过快挥发。
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
下表是某培养基的配方，下列叙述正确的是
A．从物理性质看，该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基
B．培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基缺少提供生长因子的物质
D．该培养基调节合适的pH后就可以接种菌种使用
B
（二）、纯化大肠杆菌
接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
平板划线操作
1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红
2.在火焰旁冷却接种环、并打开棉塞。
3.将试管口通过火焰。
5.将试管口通过火焰，并塞上棉花。
4.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
8.将平板倒置，放入培养箱中培养。
7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作。在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区域相连。
平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况
问题讨论
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；
②每次划线前：杀死接种环上残留的菌种，保证每次划线来自上次划线未端；
③划线结束后：杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
划线五次，灼烧六次。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落。
如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是(　 　)
A．操作前要将接种环放在火焰旁灼烧灭菌
B．划线操作须在火焰上进行
C．在5区域中才可以得到所需菌落
D．在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌
D
（多选）做“微生物的分离与培养实验时，下列叙述不正确的是（　 　）
A. 高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B. 倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C. 为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D. 用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
ABC
下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是
(　　)
A．应根据微生物代谢类型选择合适培养基并控制好培养基pH
B．实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触
C．待培养基冷却至室温后，在酒精灯火焰附近倒平板
D．使用过的培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃
C
在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图。有关叙述错误的是(　 　)
A．接种前应对培养基进行髙压蒸汽灭菌
B．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
C．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
D．甲中a区域为划线的起始位置
D
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。
稀释涂布平板法：
系列稀释操作（梯度稀释菌液）
移液管
洗耳球
微量 移液器
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
101
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
菌液
(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。
(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管
中，轻压橡皮头，吹吸三次，使菌液和水充分混匀。
(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。
浸
⑵稀释涂布平板法：
a.梯度稀释菌液：
b.涂布平板：
不超过0.1ml
各梯度下至少涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
滴
灼
涂
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
稀释涂布平板法获取的菌落
单个
或少数菌体
2.特征：
大小、形状、光泽度、
颜色、透明度等。
3.功能：
1.定义：
菌落
鉴定菌种的重要依据
固体培养基上
大量繁殖
子细胞群体
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并记录结果。
1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？
2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？
四、结果分析与评价
答：如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。
答：未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。
4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。
答：无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。
菌种的保存
1、临时保藏法
对象：
温度：
缺点：
2、甘油管藏法：
对象：
温度：
频繁使用的菌种
4℃（冰箱）
容易被污染或
产生变异
长期保存的菌种
-20℃（冷冻箱）
课题延伸
配制斜面培养基作用是什么？试管为什么要加塞棉塞？
增加接种面积。
保持通气并防止杂菌污染。
（多选）下图中甲是涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中正确的是
A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B.对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求
D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
乙
ABD
（多选）如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列有关叙述不正确的是（　 　）
A. 步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止水蒸气落在培养基上造成污染
B. 步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C. 步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数
D. 步骤④是将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌的菌落
ACD

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