资源简介

(共56张PPT)
1.2微生物的培养技术及应用
高压蒸汽灭菌
液体培养基
二 微生物的选择培养与计数
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
2.筛选原理：
（一）选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。
1.概念：
人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。
有利于目的菌株
营养
温度
pH
抑制或阻止其他微生物生长
3.选择培养基举例
（一）选择培养基
（1）利用改变培养条件进行选择培养。
（2）利用营养条件进行选择培养。
（3）利用添加某种化学物质进行选择培养。
不加碳源（含碳有机物）的培养基
分离出自养型微生物
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
稀释涂布平板法
1.原理：
稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。
在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
（二）微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
2.实验步骤：
（1）土壤取样
①取样地点要求：细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤生长。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
2.实验步骤：
②取样过程：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
（2）制备培养基
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
尿素的立体结构
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
（1）从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基。
配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基
（2）此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源： 配方二氮源：
成分：
碳源、氮源、水、无机盐
②牛肉膏蛋白胨培养基：
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
提供无机盐；
调节pH。
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
（3）样品梯度稀释
稀释10倍菌液
101
土壤10g
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
在稀释土壤溶液和涂布平板过程中每一步都要在火焰旁进行
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
注：测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板
分离不同的微生物采用不同的稀释度
不同微生物在土壤中含量不同
原因：
目的：
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
灼
⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。
涂
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
（4）取样涂布平板：
滴
③取0.1ml菌液（不超过 ），滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
浸
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
设置2个平板作为对照：
稀释涂布平板法实验操作
（5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 平均值
104
105
106
（6）菌落计数
实例分析1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（6）菌落计数
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
在恒温培养箱中培养一段时间后，3个平板上菌落数分别为65个、63个、64个，则可以推测酸奶中每毫升含菌数为_________个．
6.4×108
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
实例分析：
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在_________的平板上进行计数。
注意事项
30—300
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少____平板作为重复组。（重复实验，减少误差）。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。
⑤分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落
三个
操作提示
2）无菌操作
3）做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
4）制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
①结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
②你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
③你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异很大，可能是什么原因引起的
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
小结：两种接种方法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。
2023/3/21
2.显微镜直接计数
——直接计数法
（1）方法：
利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
菌种的保存
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3~6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
1、临时保藏法
对象：
温度：
缺点
频繁使用的菌种
4℃（冰箱）
容易被污染或产生变异
配制斜面培养基作用是什么？试管为什么要加塞棉塞？
增加接种面积。
保持通气并防止杂菌污染。
对象：
温度：
长期保存的菌种
-20℃（冷冻箱）
在3ml的甘油瓶中，装入1ml甘油后灭菌。将1ml培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的冷冻箱中保存。
2、甘油管藏法：
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
二、拓展应用
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
纤维素与纤维素酶
1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。
2.纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维二糖
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶
葡萄糖
纤维素
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
土壤取样
梯度稀释
选择培养
涂布平板
挑选
①纤维素分解菌大多分布富含纤维素的环境中，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。
1、土壤取样：
操作步骤
生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
②原因
你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
③讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。
一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。
2、选择培养
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。
①目的：
②制备选择培养基：
1、纤维素分解菌选择培养基属于____（固体、液体）培养基，原因是____________________。
液体
没有添加凝固剂（琼脂）
2、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。
提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。
将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。
3.梯度稀释
101
102
103
104
105
106
4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
（1）制备鉴别培养基:
（2）涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。
在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。
6、纯化培养
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_______________实验，纤维素酶的发酵方法有______ 发酵和______ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________ 含量进行定量测定。
发酵产纤维素酶
液体
固体
葡萄糖
高压蒸汽灭菌
液体培养基
原有前程可奔赴，亦有岁月可回首
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素
的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰
富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
练习与应用
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存
的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
练习与应用
探究-实践
(四）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素的立体结构
提出问题
1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
土壤取样
制备培养基
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
基础知识
1.土壤取样
1）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的 潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3 8cm的土壤层。
2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2.制备培养基
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
3.样品的稀释
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
4.微生物的培养与观察
30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
实验设计
结果分析与评价
1.结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30——300的平板 在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？
3.你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的_________,稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
连续划线
梯度稀释
主要步骤 _________操作
接种工具 _______
平板示 意图
平板划线
涂布器
(五）两种接种方法的比较
梯度稀释和涂布平板操作
接种环
课题小结
1.空气中微生物总数的检测？
2.水中细菌总数的检测？
3.牛奶中细菌的分离与计数？
4.土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
启示：寻找目的菌种时要根据它对________的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。
（一）选择培养基
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
生存环境
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
举例

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