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第二章 细胞工程
2.2 动物细胞工程
二、动物细胞融合技术和单克隆抗体
实例1：自然条件
受精作用
一、动物细胞融合技术
1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验
实例2：人工诱导
请同学们快速阅读课本P48页回答以下问题
1. 什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？
2. 所形成的杂种细胞有什么特点？
3. 诱导动物细胞融合的方法有哪些？
4. 动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？
1、概念：
杂交细胞
2、原理：
与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性
动物细胞融合也称________。是指_____或 ____ 动物细胞结合成一个细胞的过程。
两个 多个
单核
细胞杂交
形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的 ____ 细胞，称为 ________ 。
3、结果
一、动物细胞融合技术
4.诱导融合的常用方法：
什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。
诱导方法：
物理法：
化学法：
生物法：
灭活的病毒
电融合法
聚乙二醇（PEG)
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
↓
细胞膜被病毒颗粒穿通
↓
细胞膜连接
↓
细胞核融合，形成杂交细胞
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程：
5、意义：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
（1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。
6、应用：
(2)特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。
处理方法
诱导手段
结果
原理
请同学们看图对比动物和植物细胞融合的异同：
7、植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导融合方法
用途（结果）
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
物理（离心、电融合）
化学（聚乙二醇等）
物理、化学方法（同左）
灭活的病毒
制备单克隆抗体
抗原 动物体内
刺激
浆细胞
抗体
抗原不纯
抗体不纯
传统抗体制备方法及缺陷
缺陷： 产量低、纯度低，
且抗体的特异性差、灵敏度低。
如何解决这个问题呢？
阅读课本并思考：
科学家发现B淋巴细胞有什么特点？怎样才能获得大量的单一抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
问题１：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的
问题２：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备
科学家发现：１.体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
　　　　　　　２.每个B细胞只分泌一种特异性的抗体
单
克 隆
抗 体
克隆
一个
B淋巴细胞
细胞群
抗体
遗憾：
癌细胞
动物细胞融合
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
动物细胞融合
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验
阅读课本P48-49,了解单克隆抗体的制备过程
一个大胆的猜想
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
①未融合的细胞
②多种杂交细胞（包括B-B细胞、瘤-瘤细胞、杂交瘤细胞）
动物细胞融合
单克隆抗体制备的过程
获得产生相应抗体的B淋巴细胞
物理:电融合法
化学:聚乙二醇 生物：灭活的病毒
①未融合的细胞
②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
用特定的选择培养基
第一次筛选
已知细胞合成DNA有D （全合成途径）和S（补救途径）两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
利用两条DNA合成途径的不同特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的　 　成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。
氨基蝶呤
已知细胞合成DNA有D （全合成途径）和S（补救途径）两条途径，全合成途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，途径能被氨基蝶呤（A）阻断。补救合成途径是在次黄嘌呤（H）和胸腺嘌呤（T）存在的情况下，经过转移酶和激酶的催化合成核苷酸，进而合成DNA。所用的骨髓瘤细胞缺乏转移酶而不能通过补救合成DNA。人淋巴细胞中有这两条DNA合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖。
利用两条DNA合成途径的不同特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的　 　成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。
氨基蝶呤
①未融合的细胞
②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
多孔细胞培养板
怎样二次筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗体
结合的培养孔为阳性孔
抗体检测板
专一抗体检测呈阳性
多孔细胞培养板
①未融合的细胞
②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔内
（体内培养）
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
动物细胞培养
用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选（可进行多次）
两次筛选的目的：
第一次筛选：___________________________
筛选出杂交瘤细胞
第二次筛选：______________________________________
筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞
最终筛选杂交瘤细胞特点：
__________________________________
既能无限增殖又能产生特定抗体。
杂交瘤细胞具有该特点的原因：
___________________________________
该细胞继承了双亲细胞的遗传物质。
与传统制备的抗体相比，单克隆抗体的优点：
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗体发生特异性结合，并且可以大量的制备。
与体外培养相比体内培养优点：
不需要配制培养基、不需要严格的外界环境条件。
制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？
动物细胞融合、动物细胞培养技术
单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。顺序是？
2.单克隆抗体的应用
优点：准确、高效、简易、快速
（1）诊断试剂
如定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞
讨论2：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
放射性同位素
讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
（2）用于治疗疾病
单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤;曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。
（3）运载药物
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物
不损伤正常细胞，且用药剂量少，毒副作用小
优点：
脾是人体最大的外周免疫器官。脾实质分为白髓和红髓，前者由动脉周围淋巴鞘、淋巴滤泡和边缘区组成，主要分布B淋巴细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞，后者脾索和脾血窦组成，主要含B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。脾细胞中B淋巴细胞约占50%，因此脾作为实验材料。

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