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微生物的选择培养和计数
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选择培养基
微生物的选择培养
微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的分离
第1课时
微生物的选择培养和计数
传统工艺酿醋利用的是自然界中的野生菌种，涉及的微生物种类繁多，其中醋酸菌是决定食醋产量和质量的主要菌种。为满足食醋产量需求、缩短发酵周期，现代工业制醋一般采用人工选育的纯培养的醋酸菌进行醋酸发酵。
情境导入
如何从多种微生物中分离出优良的醋酸菌，进而完成纯培养呢？
选择培养基
一、选择培养基
PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，科学家在美国黄石国家公园的热泉中筛选出耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
1. 科学实例：
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
启示：
（1）筛选水生栖热菌的思路
耐高温的酶
耐高温生物体
寻找
高温环境（热泉、火山口）
寻
找
（2）能筛选出水生栖热菌的原因
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物
2.在冰川冻土层可以筛选 微生物
分解石油
耐寒
不是
由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
现学现用
2、选择培养基的概念
3、选择培养基的类型
类型 举例
①利用改变培养条件进行选择培养
②利用添加某种化学物质进行选择培养
③利用营养缺陷进行选择培养
将培养基放在________ __中培养，可分离出耐高温的微生物
①添加青霉素的培养基可抑制细菌的生长，分离出真菌；
缺乏氮源的培养基可筛选_____微生物
一、选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
高温环境
不加有机碳源的培养基可筛选_____微生物
固氮
自养
②加高浓度食盐的培养基可筛选出耐高盐的金黄色葡萄球菌
思考 讨论
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论1： 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是______________________，
。该类培养基的主要用途为 。
固体
且比例为1.5%~2%
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
①提供无机盐；
②调节pH。
讨论2： 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
①提供碳源；
②提供能源。
该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
思考 讨论
如何设置对照实验证明一个选择培养基具有选择性呢？
可接种牛肉膏蛋白胨培养基（基础培养基）或完全培养基作为对照，若牛肉膏蛋白胨培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
二、微生物的选择培养
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
土壤溶液直接接种到选择培养基上的培养
一、方法：稀释涂布平板法
两个基本操作： 和 。
梯度稀释
涂布平板
2.稀释涂布平板法的操作流程
土壤取样
梯度稀释
——
将10g土样加入盛有的___________锥形瓶中，充分摇匀，制成稀释______倍的土壤菌液。
取__________加入盛有__________的试管中，依次等比稀释。
90mL无菌水
10
1mL上清液
9mL无菌水
恒温培养
涂布平板
——
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板________，放入的______恒温培养箱中，培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落；
倒置
30-37℃
涂布平板
①取_____菌液滴加到培养基表面
1×107
移液枪
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器_____后，再进行涂布
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可___________，使涂布均匀
各梯度分别涂布3个平板
0.1mL
转动培养皿
冷却
二、微生物的选择培养
培养未接种的培养基的作用是对照，以检测培养基灭菌是否合格。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
培养时要将一个未接种（或接种等量无菌水）的培养基和已接种的培养基放在一起培养，为什么？
拓展：鉴别培养基
1、鉴别培养基：
在培养基中加入的某种指示剂或化学药品，与微生物的代谢产物发生反应，产生明显的变化从而鉴定出目标微生物
2、实例：
分解尿素的微生物的进一步鉴定
①原理：细菌分解尿素的反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，会使培养基的碱性增强，PH升高。
②方法：培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
尿素
分解尿素的细菌
脲 酶
PH升高
变红
酚红指示剂
氨
三、微生物的数量测定
（一）数量测定方法：
1、稀释涂布平板法——间接计数法（活菌计数法）
2、显微镜直接计数法——直接计数法
三、微生物的数量测定
阅读教材第18页“微生物的数量测定”相关知识，小组讨论完成下列问题
1、稀释涂布平板法的计数原理
当样品的______________时，培养基表面生长的一个____，来源于____________中的一个____；通过计数平板上的_______数，就能推测出样品中大约含有多少个_____；
2、稀释涂布平板法计数原则
①为保证结果准确，选择菌落数为_________的平板计数；②______稀释度下，应__________个平板进行重复计数，然后求出______；
3、稀释涂布平板法的结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________________________
②统计结果一般用_________而不是用活菌数来表示；
稀释度足够高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
30-300
同一
至少对3
平均值
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
如何保证获得的菌落数为30-300？
减小实验误差,保证实验结果更准确
选用一定稀释范围的样品液进行培养
下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，每克土壤中的菌株数约为多少？
约为1.7×109个。
M代表稀释倍数；
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
同一稀释度下菌落数的平均值
涂布时稀释液体积
×稀释倍数
用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
不能。平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
思考 讨论
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
三、微生物的数量测定
2.显微镜直接计数法：
（1）原理：利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
（2）优点：________
快速直观
（3）缺点
①统计结果一般是_____________________，不能区分死菌与活菌。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
活菌数和死菌数的总和
会使结果偏大
微生物的计数方法比较
内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
稀释涂布平板法
①分离微生物
②用来统计样品中活菌的数目
随堂练习
1、下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(　　)
A．取10 4 、10 5 、10 6 倍的土壤稀释液和无菌水各1 mL，分别涂布于各组平板上
B．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
C．统计的菌落数往往比活菌的实际数目少
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在30~300以的实验组平板进行计数
A
随堂练习
2、为了解鲜奶中细菌数量，某兴趣小组尝试对某品牌鲜奶中细菌含量进行测定。他们用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL鲜奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次，操作如下图所示。请回答有关问题：
（1）鲜奶常采用_____________法消毒，这种消毒方法对鲜奶的营养成分不被破坏。
巴氏消毒法
（2）为了对牛奶中细菌进行计数，常采用_________________法。使用该方法时，可取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上，选择下列工具中的____________进行实验操作。若其中一个平板经培养后的菌落分布如图1所示，出现图1结果可能的操作失误是_________。
（3）若用上述方法培养设置3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为_________个。运用这种方法统计的结果往往较实际值_________（填“偏大”或“偏小），原因是___________________________。
（4）消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毐后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？____________________________________。
稀释涂布平板法
B
涂布不均匀
3.4×106
偏小
个别菌落可能是由2个或多个细菌形成
稀释次数减少
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