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(共28张PPT)
微生物的培养技术及应用
1.阐明微生物选择培养的原理。
2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
学习目标
二 微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
（1）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
（2）选择培养基的设计
选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3 再转化为NO3-、NH4+ 等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
讨论
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
提示：培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素提供氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。
讨论
2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
该培养基与普通培养基相比较，共同点是都以有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
101
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
（1）梯度稀释菌液：
菌液
微量移液器
2.微生物的选择培养
浸
不超过0.1ml
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
滴
灼
涂
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
（2）涂布平板：
（1）梯度稀释菌液：
2.微生物的选择培养
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
（2）涂布平板：
（1）梯度稀释菌液：
2.微生物的选择培养
1.涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第（2）步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
问题讨论
2.培养基的制作是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
3.接种操作是否符合无菌要求？
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（1）显微镜直接计数：
可以利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
个体小的细菌在显微镜下难以观察
缺点
3.微生物的数量测定
（2）间接计数法（活菌计数法）
常用方法：
当样品的稀释度足够高时，培养基表
面生长的一个菌落，来源于样品稀释
液中的一个活菌，通过统计平板上的
菌落数，就能推测出样品中大约含有
多少活菌。
①原理：
稀释涂布平板法
②计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M。其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
③ 操作：a. 设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b.为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，最后计算出菌落平均数（如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明操作有误，需要重新实验）。
思考：活菌计数法统计的菌落数是否与活菌实际数目吻合？为什么？
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落
因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
注：误差太大，须重做或再多设几组

注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为使结果接近真实值将同一稀释度至少涂布三个平板作重复组，培养计算出菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数来表示。
⑤每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂
布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，
A、B两同学分别得到以下两种统计结果。
1、A同学筛选出150个菌落。
2、B同学筛选出50个菌落。
B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。

原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照组的设置是必不可少的。
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
结果预测：
a.如果结果与A同学一致，则证明A无误；
b.如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。
（1）分离原理：分解尿素的细菌能够产生脲酶，将尿素分解生成（NH4）2CO3或NH4HCO3，吸收利用其中的NH+4。
因此，在培养基中添加唯一的氮源————尿素，可从土壤中分离筛选出能够产生脲酶的尿素分解细菌。
尿素分解细菌分解尿素产生的（NH4）2CO3或NH4HCO3为碱性物质，可在培养基中添加酸碱指示剂———酚红，使尿素分解细菌周围的培养基呈现红色。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
图22.6 从土壤中筛选分解尿素细菌的过程
（2）实验流程：土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→统计菌落数目。
（3）统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
三、实验设计
㈠.土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3 ～ 8 cm 的土壤层。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。
你打算选择什么样的土壤做实验呢？
◆取样要求：先铲去表层土，再取样。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
（二）样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105 和1×106 倍稀释的稀释液进行平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300 的平板进行计数。
◆应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。
◆在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
细菌稀释度为104、105、106
放线菌稀释度为103、104、105
真菌稀释度为102、103、104
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
原因：土壤中各类微生物的数量是不同的。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
（三）微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间：
细 菌：30～37℃ 培养1～2d
放线菌：25～28℃ 培养5～7d
霉 菌：25～28℃ 培养3～4d
一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种我微生物表现出稳定的菌落特征。包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。
菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。
（四）操作提示
1. 将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2. 要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3. 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4. 本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
（五）结果分析与评价
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
通过对照实验，若培养物有杂菌污染，对照的培养基菌落数偏高；
若培牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数远大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30 ～ 300 的平板？在这一稀释度下，是否至少有2 个平板的菌落数接近？
提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验。
鉴定分离的菌种的方法
（1）表型微生物鉴定：该方法依据表型特征的表达来区分不同的微生物，是经典的微生物分类鉴定法；它以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征与典型微生物的差异进行鉴别。
（2）基因型微生物鉴定：由于大部分微生物的核酸序列是高度保守的，所以聚合酶链式反应（PCR）、DNA分子杂交技术等可以用于鉴定微生物。基因型微生物鉴定方法比表型微生物鉴定方法理论上更值得信赖。
菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌 落
菌落由单个细菌（或其他微生物）细胞或少数同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。

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