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微生物的培养技术及应用
简述培养基的配方和微生物培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。
学习目标
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
一 微生物的基本培养技术
在实验室培养微生物的关键：
1.提供合适的营养 ——培养基
2.提供合适的环境条件 ——培养条件
3.要确保其他微生物无法混入 ——无菌技术
4.将需要的微生物分离出来 ——分离培养
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到。若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。
培养基
人们按照微生物对__________的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。
培养基用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
营养物质
生长繁殖
主要作用
提供微生物生长繁殖所需碳元素的营养来源。
提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养来源。
为微生物生命活动提供最初能量来源。
提供调节微生物正常代谢必需的、不能用简单的碳源和氮源自行合成的微量有机物，如维生素、含氮碱基等。
为微生物提供除碳源、氮源以外的其他各种重要元素。
微生物最基本的营养要素，在微生物生存中起重要作用。
培养基所含的微生物营养要素及其主要作用
微生物的营养要素
碳源
氮源
能源
生长因子
无机盐
水
种类及举例
无机碳源（CO2、HCO3-等，适于自养生物。）
有机碳源（葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，适于异养生物。）
无机氮源（N2、NH4＋、NH3、NO3-等）
有机氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等）
KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。
注意：在提供几种主要营养物质外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2 的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
培养基种类及用途
种类 是否含凝固剂 用途
固体培养基
半固体培养基
液体培养基
（一）按物理性质分
1.5%-2.5%
0.2%-0.7%
否
微生物的分离与鉴定、活菌计数等
观察微生物运动、保藏菌种等
常用于工业生产
固体培养基：菌落
半固体培养基：运动
液体培养基：生长
（二）按化学成分
种类 化学成分 用途
天然培养基
合成培养基
不明确
明确
工业大规模生产
分类、鉴定
（三）按培养基的功能（用途）
1.基础培养基
（1）成分：一般微生物生长繁殖所需要的基本物质
（2）常用类型：牛肉膏蛋白胨培养基（20.0g琼脂）
种类 制备方法 原理 用途 举例
选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。
依据某些微生物的特殊营养需求或对某些物质的敏感性
依据微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定的反应，产生明显的特征变化。
培养、分离出特定微生物从众多微生物中分离所需的微生物
鉴别不同种类微生物
①加入青霉素分离酵母菌和霉菌②缺氮培养基分离固氮菌③高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌④无碳培养基分离自养型微生物
①伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌②刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
一、含义
泛指在分离、接种和培养微生物的操作中，所有防止其他微生物污染的方法。是成功地培养微生物的关键。
无菌技术
二、范围
1.对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒。
2.对培养器皿、接种用具、培养基等进行灭菌。
3.在酒精灯旁操作
4.已灭菌的材料与周围的物品分开。
三、消毒、灭菌
（一）消毒：是指较为温和物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（不包括芽孢、孢子）
1.巴氏消毒法
70℃～75℃煮30min或在85℃煮15min；杀灭非芽孢致病菌，不破坏物料原风味；适用于对牛奶、啤酒等消毒。
2.煮沸消毒法
在100℃煮沸5 ～6min可以杀死微生物细胞和部分芽孢。
3.化学药物消毒法
①酒精消毒：使细胞脱水、蛋白质变性。
②氯气消毒：氯气溶于水形成盐酸和次氯酸，次氯酸可放出新生态的氧，从而杀死细胞。
③其他：升汞、高锰酸钾、臭氧、甲酚皂、醋酸等等。
4.紫外线消毒法
例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
将上述两表内容归纳提炼如下：
（1）紫外线能破坏DNA的结构。化学药剂消毒方法的作用原理是使菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭芽孢和孢子。
（2）巴氏消毒法可以杀死牛奶中的绝大部分微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
（3）微生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
（二）灭菌：是指使用强烈的理化方法，杀死物体内外所有微生物（包括芽孢、孢子）
1.湿热灭菌
这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅（见右图）就是以水蒸气为介质，在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30min来灭菌的。可用于培养基、多种器材、物品的灭菌。
2、干热灭菌
用干热灭菌箱在160~170℃加热2~3h。用于耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等。
将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。
3.灼烧灭菌
讨论:1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？
在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。
2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？
如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故 。
3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？
空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染 。
1. 接种工具：
① 接种针：直线状，多用于固体培养基穿刺接种。
② 接种环：环状，常用于细菌和酵母菌的斜面、平板接种。
斜面
平板
接种针、钩、环
③ 接种钩：直角状，多用于霉菌和放线菌的接种。
微生物的纯培养
2. 涂布器：多用于菌种的分离或微生物平板活菌计数时涂布。
3. 吸管：0.1、0.2、0.5、1、5、10mL等移液管，常用于液体接种及菌悬液系列稀释。
4. 试管、培养皿、锥形瓶等
5. 消毒、灭菌设备：酒精灯、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅等。
6. 无菌实验室、超净工作台等
超净工作台
无菌实验室
一、培养物与纯培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物的纯培养
二、纯培养的过程
配置培养基→灭菌→接种→分离和培养
三、酵母菌的纯培养
1.制备培养基
（1）配置培养基
称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000 mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000 mL。
（2）灭菌：
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。
将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃灭菌2h。
防止污染和挥发
灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用
（3）倒平板
培养基冷却至约50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板：
②将瓶口迅速通过火焰，灼烧灭菌
①左手拔出棉塞
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 ～ 20 mL）
倒入培养皿，立即盖上
皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
①加琼脂的目的是什么
②在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的
锥形瓶的目的是什么？
③培养皿能否用高压蒸汽灭菌？
作为凝固剂。
在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用
不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.
问题讨论
答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
问题讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
2.接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
问题讨论
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
②杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
问题讨论
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
4.平板划线时不能划破培养基的原因？
结果分析与评价
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
2. 在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
纯化后菌种的保存方法
（1）临时保藏
①适用范围：频繁使用的菌种。
②方法：将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
③缺点：保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
（2）甘油管藏
①适用范围：长期保存的菌种。
②方法：在3mL的甘油瓶中，装人1mL甘油后灭菌。将1mL的培养菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的冷冻箱中保存。
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类（包括一些简单的糖和膳食纤维等）、蛋白质（包括多种酶）、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。可以通过查阅专业学术期刊上发表的有关研究论文，或亲自检测水果“酵素”的成分，获取科学可靠的证据进行全面论证。
思维训练
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。
有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？
微生物
原核:
真核
非细胞类：
细菌、放线菌、支原体、蓝藻等
酵母菌、霉菌等
真菌：
原生生物
病毒、类病毒、朊病毒等
①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小；⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。
微生物的类群
显微藻类：衣藻、小球藻等
原生动物：草履虫、变形虫等
微生物的特性
拓 展
（一）球菌
（二）杆菌
（三）螺旋菌
肺炎双球菌
金黄色葡萄球菌
乳酸链球菌
大肠杆菌
苏云金芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌
霍乱弧菌
幽门螺旋菌
齿垢密螺旋体
细菌的形态
细菌的芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体（不是繁殖体），叫做芽孢。
芽孢的壁很厚，含水量极低，抗逆性极强（对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力）。
细菌芽孢的结构模式图
环境适宜时，芽孢可以萌发，形成一个细菌。
病毒的繁殖
吸附
注入
合成
释放
组装
噬菌斑即噬菌体侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑（“负菌落”）。
在适当条件下，一个噬菌体形成一个噬菌斑。

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