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第一章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
人教版·选择性必修3
（第一课时）
微生物的基本培养技术
问题探究：
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
失败
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
衣藻
本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
1. 微生物
微生物的基本培养技术的概述
病毒：
SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒。
原生生物：
草履虫、变形虫、衣藻等。
真菌：
酵母菌、毛霉等；
细菌：
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
大肠杆菌
酵母菌
毛霉
草履虫
新冠病毒
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。
为微生物提供合适的营养和环境条件
确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来
培养基
无菌技术
2. 发酵工程的重要基础
3.在实验室培养微生物的基本思路：
微生物的基本培养技术的概述
一、培养基的配制
1. 培养基的定义
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出其生长繁殖的营养基质叫做培养基。
① 培养、分离、鉴定、保存微生物。
② 积累其代谢物。
2. 培养基的用途
① 分类依据：物理性质
3. 培养基的种类
液体培养基
不含凝固剂，呈液体状态
微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
固体培养基
+琼脂
凝固剂
② 分类依据：功能
3. 培养基的种类
一、培养基的配制
混合样品
选择培养基上部分菌种才能生长
普通培养基上所有菌种都能生长
选择培养基
鉴别培养基
目的菌
鉴别培养基上目的菌周围出现透明圈
非目的菌
鉴别培养基上非目的菌周围无明显现象
② 分类依据：功能
3. 培养基的种类
一、培养基的配制
选择培养基
培养基中加氨苄青霉素
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌？
没有氨苄青霉素抗性的细菌
具有抗氨苄青霉素能力的细菌
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
一、培养基的配制
培养基的类型及用途
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂（易溶于沸水，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固）
扩大培养、工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
加入某种化学物质，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
一、培养基的配制
4. 培养基的基本成分
基本成分：
碳源
氮源
水
无机盐
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
无机氮源：
NH4＋、NO3- 、NH3、硝酸盐等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
——自养微生物
——异养微生物
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
K2HPO4、MgSO4、NaCl、CaCl2、Ca(NO3)2、FeSO4等
——调节酸碱平衡、 维持渗透压
氮源是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
除上述营养物质外，培养基是否还需要其他物质呢？
—固氮微生物
——水是微生物生长和代谢必不可少的营养物质。
一、培养基的配制
4. 培养基的基本成分
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
表1-1 1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、O2 的需求。
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
培养基中添加维生素
培养基pH调至酸性
提供无氧的条件
培养基pH调至中性或弱碱性
一、培养基的配制
营养要素 来源 功能
碳源 无机碳源 CO2、NaHCO3等含碳无机物 ①构成细胞物质和一些代谢产物；
②有机碳既是碳源又是能源
有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 氮源 无机氮源 N2、NH3、铵盐、硝酸盐等 将无机氮合成含氮的代谢产物
有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
水 外界摄入 ①良好的溶剂；
②维持生物大分子结构的稳定
无机盐 无机物 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素
生长因子 维生素、氨基酸、碱基 ①酶和核酸的组成成分；
②参与代谢过程中的酶促反应
培养基的类型及用途
二、无菌技术
消毒
灭菌
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌污染展开。
二、无菌技术
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药物消毒法
紫外线消毒
1. 消毒
100℃煮沸5~6min。
可杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
62~65℃煮30min或80~90℃下处理0.5~1min。可杀死绝大部分微生物，不破坏食物的营养成分。
用75%酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源等。
对接种室、接种箱或超净工作台用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
二、无菌技术
用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。
某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠体。
芽孢萌发可形成细菌体。
芽孢
孢子
2. 灭菌
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞，能直接发育成新个体。
芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。
二、无菌技术
湿热灭菌法
干热灭菌法
灼烧灭菌法
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱
接种环灼烧灭菌
2. 灭菌
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
二、无菌技术
2. 灭菌
湿热灭菌法
高压蒸汽灭菌锅
利用
沸水
流通蒸汽
高压蒸汽
进行灭菌的方法
高压蒸汽灭菌
100 kPa
121℃
15~30 min
效果最好
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
二、无菌技术
干热灭菌法
干热灭菌箱
灭菌物品
放入
密闭容器
160~170℃
2~3h
耐高温和需要保持干燥的物品
玻璃器皿
金属用具
2. 灭菌
涂布器
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。
接种环
二、无菌技术
2. 灭菌
接种工具
灼烧灭菌法
涂布器
接种环
接种针
其他金属工具
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
接种过程
试管口
瓶口
通过酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
迅速彻底灭菌
充分燃烧层
（外焰）
原理：使微生物燃烧。
二、无菌技术
消毒和灭菌的比较
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活用品
100℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体（如牛奶、啤酒、果酒、酱油等）
62～65℃煮30 min
或 80～90℃煮30s～1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等，如用酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具，接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱，
160～170 ℃，加热2～3h
湿热灭菌
培养基等，生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，
温度121 ℃，15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
（最彻底）
二、无菌技术
3. 无菌技术的内容
消毒和灭菌的主要方面
对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒
将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌
消毒和灭菌工作之后
避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
二、无菌技术
知识巩固
1.无菌技术的主要方法及适用对象(连线)

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