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(共22张PPT)
基因表达载体的构建
微专题复习
同尾酶的意义
同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
考点突破一 探究选取限制酶的方法
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【典型例题1】
人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
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【典型例题1】
切割载体和γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入载体中某个标记基因的上游，检测该标记基因是否表达。
1.如果你是科研团队中的一员，要确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。你会提供怎样的研究思路？
考点突破一 探究选取限制酶的方法
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【典型例题1】
2.为将调控序列及启动子的扩增产物插入载体中，需对载体切割，选取的限制酶是什么？为什么？
MunI和XhoI。因为NheI、EcoR会破坏终止子、荧光蛋白基因，而MunI和XhoI不会。
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【典型例题1】
3.为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。在R及F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶分别是什么？
EcoRI、SalI
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归纳总结—选取限制酶时需要注意哪些事项？
1.保证目的基因、复制原点、启动子、终止子、标记基因的完整。
2.用同种限制酶或同尾酶切割载体和含目的基因的DNA片段。
3.使目的基因按正确的方向插入启动子和终止子之间。
考点突破一 探究选取限制酶的方法
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【拓展提升】
科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是终止密码子和起始密码子对应的基因位置。
考点突破一 探究选取限制酶的方法
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【拓展提升】
1.若要构建MT基因表达载体。你会选择哪一种载体？理由是什么？
选择载体P。理由是载体P含有能产生平末端的酶切位点，而载体E只有能产生黏性末端的酶切位点。
(选择载体E。理由是载体E含有启动子和终止子，而载体P没有。)
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【拓展提升】
2.利用你选择的载体，如何构建MT基因表达载体？
若选择载体P：在引物1、4上分别添加终止子、启动子，通过PCR扩增MT基因；然后用EcoRV或SmaI切割载体P；再用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成MT基因表达载体。
若选择载体E：在引物1、4上分别添加PstI、XhoI的识别序列，通过PCR扩增MT基因后，用XhoI和PstI切割MT基因；然后用XhoI和PstI切割载体E；再利用DNA连接酶将MT基因与载体E相连，构成MT基因表达载体。
考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
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【典型例题2】
科研人员发现了一种药物蛋白G，期望利用在真核细胞中广泛表达的A基因上游的调控序列驱动G蛋白基因表达。然而，自然G蛋白来源有限，不能满足科研和临床应用的需要。为了实现G蛋白的工厂化生产，科研人员期望利用在真核细胞中广泛表达的A基因上游的调控序列驱动G蛋白基因表达。相关信息如图所示。
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【典型例题2】
2.为了检验F1～R片段是否成功插入载体中，科研人员利用限制酶Mun I和EcoR I对表达载体进行酶切后电泳检测。电泳中出现多大的条带则说明该片段已成功插入载体？
1.上图体现了哪些筛选重组DNA的方法？
抗生素抗性检测、DNA电泳检测
246bp
考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
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【典型例题3】
某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中进行保存。LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质。
根据上述资料，试分析如何判断大肠杆菌中是否导入了该目的基因？
培养基中应适量添加氨苄青霉素和X-gal，若产生白色菌落说明导入了该目的基因。
考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
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【高考试题再研究】
人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是______________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要______________种酶。
考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
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【高考试题再研究】
(2) 将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是______________。
(3) 向培养液中添加适量的______________，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于______________，理由是______________。
我能行！
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考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
【参考答案】
（1）SalI（2分） EcoRI（2分） 6（1分）
（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达（2分）
（3）雌激素（1分）
引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上（2分）
根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上（2分）
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精准审题，规范答题
1.精读图文，精准获息
2.理清思路，构建蓝图
3.由易到难，逐一突破
技巧点拨
归纳总结—筛选重组DNA常用的方法有哪些？
1.载体表型选择法。
（如抗生素抗性、荧光检测、半乳糖苷酶显色反应）
2.DNA电泳检测法。
考点突破二 探究筛选重组DNA的方法
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达标检测
为研究肝癌致病机理，科研工作者利用下图所示的差异杂交法和基因工程获取相关癌基因以作进一步研究。
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达标检测
(1)图1中，A过程是________，D过程需要回收________（填“未杂交”或“杂交分子”）的含32P的cDNA单链，继而通过人工合成获得双链cDNA，并用其构建基因文库。
(2)从图1构建的基因文库中获取的目的基因，一般还需进行人工改造后才能用于基因表达载体的构建，改造内容除了在基因两端添加________的识别序列外，还需添加________，以便其随载体导入到受体细胞后，能正常调控表达过程。
(3)图3中能作为载体的最理想的质粒是________，理由是________。为筛选出成功导入目的基因的受体细胞，培养基中应适量添加________。
(4)若用EcoR I完全切上述获得的重组质粒，并进行电泳观察，可出现四种长度不同的片段，其长度分别为1.7kb、5.3kb、________。
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达标检测
(1) 逆转录 未杂交
(2) NotI 启动子和终止子（2分）
(3) X 质粒X有四环素抗性基因和lacZ基因，便于筛选目的基因；质粒Y的复制原点内有NotI识别序列，用NotI切割时，复制原点被破坏（2分）
四环素和X-Gal（2分）
(4) 3.1kb、3.9kb（2分）
精准审题，规范答题！
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同学们
你们像限制酶一样准确理解；
你们像T4DNA连接酶一样博学多才；
你们像TaqDNA聚合酶一样历经千锤百炼；
不断地导入新知，高效表达。
相信你们的梦想一定会像六月的盛夏一样开出灿烂的花，结出丰硕的果！

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