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【备考2024】生物高考一轮复习
第38讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
[课标要求] 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质6.举例说明依据人类需要对原蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程7.转基因产品的安全性引发社会的广泛关注8.中国禁止生殖性克隆人9.世界范围内应全面禁止生物武器
[核心素养](教师用书独具) 1.结合生活或生产实际，举例说出基因工程及相关技术的基本原理。(生命观念)2.尝试构建基因工程及蛋白质工程的流程图。(科学思维)3.学会细胞中DNA的提取和鉴定的方法、PCR技术原理和操作。(科学探究)4.坚持正确的社会舆论导向，理性看待转基因产品的安全性。(社会责任)
考点1　DNA重组技术的基本工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基本工具
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)
①来源：主要是原核生物。
②作用特点：具有专一性，表现在两个方面
a．识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
b．使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
③作用结果：产生黏性末端或平末端。
A．eq \a\vs4\al()
b.
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
②类型
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端
(3)基因进入受体细胞的载体
①作用：将外源基因送入受体细胞。
②常用载体：质粒、噬菌体、动植物病毒。
③最常用载体：质粒。
a．本质：裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
b．特点
1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。 (√)
2．DNA重组技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 (×)
提示：DNA重组技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体。
3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 (×)
提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 (√)
5．做载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (√)
6．DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在－4℃冰箱中放置几分钟。 (×)
提示：DNA粗提取时，洋葱研磨液经纱布过滤后，应放在4℃冰箱中放置几分钟。
1．用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？(选择性必修3　P71“文字信息”)
提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。(选择性必修3　P72“旁栏思考”)
提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
1．限制酶的作用是______________________________________________
______________________________________________________________。
提示：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
2．实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是________________________________________
_____________________________________________________(答出两点即可)。
提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害
1．与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2．限制酶的选择方法
图甲　　　　　　　图乙
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，与图乙所示质粒连接。
1．软米基因会导致水稻稻米合成直链淀粉含量降低呈现软米特征，人们大多喜欢软米的口感，为获得高产软米粳型水稻，软米基因Wxmq与蜡质基因Wx互为等位基因，序列长度相同均为557碱基对(bp)，但基因内部出现了限制酶NlaⅢ识别位点，用限制酶NlaⅢ处理不同植株的DNA片段，获得电泳图如下，分析可知含有纯合软米基因的植株为哪几个？(填植株编号)
软米基因检测结果
提示：1 4 5 9 10
2．限制性内切核酸酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
提示：
基因工程工具酶的应用
1．(2021·泰州高三模拟)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是(　　)
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200bp
D．限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂
D　[当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由图可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。]
基因工程载体的应用
2．(2021·十堰高三模拟)如下图为农杆菌Ti质粒的T DNA区段结构示意图。农杆菌附着植物细胞后，T DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体上，继而诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤。以下有关叙述不正确的是(　　)
A．Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外
B．植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达有关
C．清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长
D．利用T DNA进行转基因时需保留LB、RB序列
C　[质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，存在于细胞质中，具有自我复制能力的环状双链DNA分子，Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外，A正确；因为质粒整合到植物染色体上以后能诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤，所以可推测植物肿瘤的形成与质粒上的细胞分裂素和生长素基因过量表达有关，B正确；清除植物肿瘤组织中的农杆菌后，还有整合到植物DNA上的T DNA，通过基因的复制表达也会导致肿瘤继续生长，C错误；农杆菌的T DNA能整合到染色体上的前提是Ti质粒上的LB、RB序列被剪切，才能连接整合到植物细胞DNA上，D正确。]
考点2　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①根据已知结构和功能进行筛选。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①构建基因文库获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
3．将目的基因导入受体细胞
4．目的基因的检测与鉴定
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (√)
2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 (√)
3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (×)
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 (√)
5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 (√)
6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (√)
1．你知道新冠病毒核酸检测试剂盒的检测原理吗？(选择性必修1　P82“文字信息”)
提示：新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品，它的工作原理是从待测人员咽部采集样本，进行反转录聚合酶链式反应(RT PCR)，通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染)，反之表明样本中没有病毒(未感染)。
2．利用大肠杆菌可生产出重组人胰岛素，联系前面有个细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？(选择性必修3　P87“从社会中来”)
提示：不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
1．为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，其作用在于
________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
提示：当诱导物存在时，激活或抑制目的基因的表达
2．确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度，要从个体生物学水平进行鉴定，具体操作是____________________________________________
__________________________________________________________________。
提示：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
3．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是______________________________
___________________________________________________________________。
提示：仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因
1．PCR技术的过程
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过逆转录或人工方法合成的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
1．设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：____________________________________________；
②第2组：____________________________________________。
提示： 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．利用以下材料，写出培育抗虫水稻的方案。
材料：携带抗虫基因的Ti载体，农杆菌，优良水稻品种的愈伤组织，必要的化学药品。
提示：将携带抗虫基因的Ti载体导入农杆菌，将转化成功的农杆菌与水稻愈伤组织在培养液中培养，筛选含有抗虫基因的愈伤组织置于诱导分化培养基上继续培养。
考查目的基因的获取
1．(不定项)(2021·大连高三一模)PCR技术可用于遗传多样性的研究。下图是对两个跳虫(A和B)DNA分析的实验过程，有关叙述正确的是(　　)
A．蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA
B．耐高温的DNA聚合酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的合成
C．将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小
D．阴性对照是未加DNA模板但加入PCR扩增过程所需的混合物，以监测试剂是否污染
ABCD　[蛋白酶可以分解组织中的蛋白质(如膜蛋白、染色体蛋白质)，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA，A正确；耐高温的DNA聚合酶在高温下仍保持活性，在PCR中催化子链的延伸，B正确；将已知长度的DNA片段装到凝胶上作为参照，通过对比，可以估测样本DNA片段的大小，C正确；阴性对照是未加DNA模板，但加入PCR扩增过程所需的混合物，通过电泳结果的比较，以监测试剂是否污染，D正确。]
考查基因过程的基本操作程序
2．(2021·泰安高三模拟)核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。下图为针对某种RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路：
下列相关叙述正确的是(　　)
A．该疫苗中核酸可作为抗原刺激人体产生体液免疫
B．步骤①中对S蛋白基因进行扩增，需要用到DNA聚合酶和解旋酶
C．步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，只需不破坏标记基因
D．核酸疫苗能在人体细胞中成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子
D　[该疫苗中核酸用来编码抗原蛋白，核酸本身不能作为抗原刺激人体产生体液免疫，A错误；步骤①中对S蛋白基因进行扩增，利用的是PCR技术，该过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，B错误；步骤②构建重组表达载体，其S基因应插入载体，不能破坏标记基因、启动子序列和终止子序列等，C错误；核酸疫苗中的核酸源自病毒等病原体，其在人体细胞中能成功表达S蛋白，说明了生物界共用一套密码子，D正确。]
3．(不定项)(2021·潍坊高三期末)基因工程是一种 DNA 操作技术，其表达载体的构建和检测筛选是两个重要步骤。下图1为某种质粒简图，箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点。已知目的基因X的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。图2表示运用影印培养法(指在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落的一种微生物培养方法)检测表达载体是否导入大肠杆菌。下列有关叙述错误的是(　　)
图1　　　　　　　　　　图2
A．同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒，可避免酶切后质粒的自身环化
B．转化方法是将质粒表达载体溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的大肠杆菌混合
C．培养基 A 和培养基 B分别含有四环素和青霉素
D．从筛选结果分析，含目的基因X的菌落是1、2、3、5
CD　[为避免酶切后质粒的自身环化，可同时使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒，A正确；转化方法是将质粒表达载体溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的大肠杆菌混合，B正确；用EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的大肠杆菌能在含有青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别含有青霉素、四环素，含目的基因X的菌落是4和6，C错误，D错误。]
4．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中__________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有_________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________
______________________________________________________________。
[解析]　(1)由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coliDNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
[答案]　(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)复制　限制酶切割位点　选择性培养　(4)RNA聚合酶识别和结合的部位
考点3　基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物。
②转基因抗病植物。
③转基因抗除草剂植物。
④改良植物的品质。
⑤提高动物的生长速率。
⑥改善畜产品的品质。
(2)在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造来生产药物；②利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物；③用转基因动物作器官移植供体。
(3)在食品工业方面的应用
利用基因工程生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：改造或合成基因。
③结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)流程图
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(3)蛋白质工程的应用
①利用蛋白质工程研发药物。
②利用蛋白质工程改进或开发新的工业酶。
③在农业方面，改造光合作用相关的酶。
1．转基因抗病农作物不需要使用农药。 (×)
提示：转基因抗病农作物减少了农药的使用。
2．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物。 (√)
3．利用基因工程技术，将人胰岛素的基因转入大肠杆菌后，大肠杆菌内表达出的胰岛素与人的胰岛素结构相同。 (×)
提示：大肠杆菌属于原核生物，无内质网和高尔基体对核糖体产生的肽链进行加工，故表达出的胰岛素与人的胰岛素结构不同。
4．蛋白质工程常借助计算机建立蛋白质的三维结构模型。 (√)
5．对蛋白质的结构设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。 (√)
6．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 (√)
1．野外种植转基因抗A害虫植物的同时，还种植一定量的同种不抗虫植物，可降低抗性害虫在整个害虫种群中所占比例的增加速率。试分析其中的原因。(选择性必修3　P88“文字信息”)
提示：种植一定量的同种不抗虫植物，对抗性害虫的选择作用减弱。
2．对天然蛋白质进行改造，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？ 原因是什么？(选择性必修3　P93“文字信息”)
提示：通过对基因的操作来实现基因控制蛋白质的合成。基因能遗传给下一代。
1．用膀胱生物反应器也能生产干扰素，与乳腺生物反应器相比，其优势是
_________________________________________________________________
____________________________________________(答出2点即可)。
提示：不受年龄限制；不受性别限制；提取简单、高效
2．若要获得抗盐能力更强的抗盐基因，可以对基因H进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程可以通过蛋白质工程完成，该过程的基本思路是_______
_________________________________________________________________。
提示：①预期耐盐蛋白质的功能；②设计耐盐蛋白质的结构；③推测应有的氨基酸序列；④找到对应的基因序列
1．乳腺生物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子。
(3)受体细胞：哺乳动物的受精卵。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3．蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目 蛋白质工程 基因工程
过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
通过对Bt蛋白质三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，写出其实验设计思路。
提示：参照密码子表，找到合成该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。
考查基因工程的应用
1．(不定项)如图是培育表达出人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ箭头所示为三种限制酶的酶切位点。下列相关叙述正确的是(　　)
A．要将人乳铁蛋白基因插入载体，需用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制酶同时酶切载体和目的基因
B．图中能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是复制原点
C．为检测人乳铁蛋白基因是否成功表达，可采用核酸分子杂交技术
D．该过程中的早期胚胎一般需要培养至桑葚胚或囊胚阶段再进行胚胎移植
AD　[将人乳铁蛋白基因插入载体，不能破坏目的基因，酶切的载体和目的基因两端露出的黏性末端碱基序列应相同，分析可知，应选用二者共有的限制酶HindⅢ和BamHⅠ切割，A正确；能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是启动子、终止子等，B错误；为检测人乳铁蛋白基因是否成功表达，可采用抗原—抗体杂交技术检测，C错误；胚胎移植时，早期胚胎一般需要培养至桑葚胚或囊胚阶段再进行移植，D正确。]
考查蛋白质工程及应用
2．(2021·辽宁选择性考试)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B．加入连接肽需要通过改造基因实现
C．获得N1的过程需要进行转录和翻译
D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
D　[在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。]
3．酿酒酵母(一种酵母菌)在无氧条件下可以将木糖转化为乙醇。首先，木糖还原酶利用NADPH(还原性辅酶Ⅱ)转化木糖为木糖醇，然后木糖醇脱氢酶利用NAD＋(辅酶Ⅰ)转化木糖醇为木酮糖，后者进一步在其他条件下转化为乙醇。科学家利用蛋白质工程对相关酶进行改造，显著提高了乙醇的产量。下列相关说法错误的是(　　)
A．NADPH供氢给木糖后不会转化为NAD＋
B．若两种酶的比例不平衡，可能会造成木糖醇积累
C．酿酒酵母的线粒体在无氧条件下基本不发挥作用
D．科学家对相关酶改造的过程中，需要合成全新的基因
D　[NADPH供氢给木糖后不会转化为NAD＋，因为这是两种不同的辅酶，A正确；题意显示，木糖还原酶利用NADPH(还原性辅酶Ⅱ)转化木糖为木糖醇，然后木糖醇脱氢酶利用NAD＋(辅酶Ⅰ)转化木糖醇为木酮糖，在这个连续反应中，若两种酶的比例不平衡，可能会造成木糖醇积累，B正确；酿酒酵母将木糖转化为酒精的过程是在无氧条件下进行的，无氧呼吸的场所是细胞质基质，故线粒体在无氧条件下基本不发挥作用，C正确；科学家对相关酶改造的过程中，并不需要合成全新的基因，而是对原有基因进行必要的修饰，D错误。]
考点4　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)实验步骤
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
3．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1_mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．DNA粗提取中的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。
1．(2021·江苏百校高三联考)如图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是(　　)
①　　　　②　　　③　　　 ④
A．图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精
B．图①和图③都需用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，以防止破坏DNA
C．若图③操作后接图②操作，则DNA留在滤液中
D．若图④操作后接图②操作，则DNA留在纱布上
B　[DNA不溶于酒精，95%的冷酒精凝集效果最佳，所以图①的原理是DNA不溶于酒精，某些蛋白质可溶于酒精，以便除去溶于酒精的杂质，提取含杂质较少(或较纯净)的DNA，A正确；图①玻璃棒逆时针方向搅拌，目的是提取出含杂质较少的DNA，图③玻璃棒顺时针方向搅拌，目的是溶解细胞核内的DNA，B错误；图③操作是加入蒸馏水，破碎细胞，图②操作是过滤，获取含DNA的滤液，使DNA留在滤液中，C正确；图④操作是去除滤液中杂质，析出DNA，图②操作是过滤，将DNA留在纱布上，D正确。]
2．下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水胀破，释放DNA
C．DNA 不溶于95%的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
C　[兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；植物材料需先用洗涤剂溶解细胞膜，B错误；DNA不溶于95%的冷酒精和0.14 mol/L的NaCl溶液，而溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正确；将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色，D错误。]
3．(2021·黄冈高三二模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1∶50～1∶100，在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA。下列相关说法错误的是(　　)
A．可以利用不对称PCR 来制备探针
B．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
C．用不对称PCR方法扩增目的基因时需知道基因的全部序列
D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
C　[探针也是单链DNA，根据题意可知不对称PCR可用来合成大量的单链DNA，A正确；复性温度过高会导致引物无法与模板结合，从而无扩增产物形成，B正确；PCR时不需要知道扩增基因的全部序列，只需要知道两端的部分序列即可，C错误；单链DNA和双链DNA的分子量不同，电泳可以将其分离，D正确。]
4．(不定项)(2021·扬州高三模拟)20世纪70年代，Fred sanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4个试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中错误的是(　　)
A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶
B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C．测得未知DNA的序列为5′ GATTCGAGCTGA 3′
D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5′末端
ACD　[PCR测序需要引物和耐高温的DNA聚合酶，A错误；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾，B正确；由图可知：测得未知DNA的序列为5′ TCAGCTCGAATC 3′，C错误；ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D错误。]
考点5　生物技术的安全性和伦理问题
1．转基因成果
(1)基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域是对微生物的基因改造。
(2)转基因动物方面，科学家将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内，培育了一批生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜；转基因植物方面，目前已经培育出了大批具有抗虫、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物。
(3)种植转基因植物面积较大的国家有美国、巴西、阿根廷、加拿大等；种植的转基因作物中大豆和玉米最多，其次是棉花和油菜。
(4)对转基因产品安全性的争论及理性看待转基因技术
①人们具有不同的价值观取向，因此对转基因技术就会产生不同见解。
②转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评价。
2．关注生殖性克隆人
(1)生殖性克隆：指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
(2)治疗性克隆：指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
(3)我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
3．禁止生物武器
(1)种类：致病菌类、病毒类、生化毒剂类等。
(2)中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
1．转基因技术已被用于减少啤酒酵母双乙酰的生成。 (√)
2．理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 (√)
3．可以运用重组DNA技术进行生殖性克隆人研究。 (×)
提示：不允许任何人进行生殖性克隆人研究。
4．生物武器仅包括病毒类。 (×)
提示：生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
5．提供骨髓中的造血干细胞并不会对婴儿的健康造成损伤。 (√)
6．克隆动物实验存在流产率高、胎儿畸形率高和出生后死亡率高等问题。 (√)
1．将来自玉米的α 淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以防止转基因花粉传播的原因是什么？(选择性必修3P102“相关信息”)
提示：由于α 淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
2．我国科学家用4种小分子化合物诱导小鼠的成纤维细胞转变成了iPS细胞，这种诱导方法与转入相关因子诱导产生iPS细胞相比，其优点是什么？(选择性必修3　P108“文字信息”)
提示：避免了转入相关因子诱导iPS细胞可能带来的致癌风险。
1．转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是什么？_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
2．治疗性克隆获得的组织器官在移植时一般不会出现排异反应，其根本原因是什么？___________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：治疗性克隆获得的组织和器官的绝大多数遗传物质和患者相同
比较试管婴儿和设计试管婴儿
(1)试管婴儿和设计试管婴儿过程(如图所示)
(2)试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
项目 试管婴儿 设计试管婴儿
不同点 过程 无图中d过程 多出图中d过程
技术手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预防及治疗
相同点 二者都是体外受精、体外进行早期胚胎培养，再经过胚胎移植，从生殖方式上都为有性生殖
1．世界首例抗乳腺癌“设计试管婴儿”的诞生引发了伦理争议，请你说明反对这一技术应用于人类的理由。
提示：在“设计试管婴儿”过程中需对胚胎进行筛选，这是对生命的不负责任；含有致癌基因的胚胎在长大成人后，也有不患病的可能；基因筛选会在不久的将来愈演愈烈，最终变成从相貌、智力等方面对人类胚胎事先进行筛选，变成名副其实“设计”出来的婴儿(答对一点即可，其他合理答案也可)。
2．尝试写出禁止生物武器的理由。
提示：生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。把这些病原体直接或通过食物、生活必需品等散布到敌方，可以对军队和平民造成大规模杀伤等后果。
考查生物技术的安全性
1．下列关于“转基因”的叙述，错误的是(　　)
A．转入的外源基因有可能使作物的其他基因的表达受到影响
B．被转移的基因是功能已知的基因，人们对它们研究得已经相当透彻，绝对不会引起安全性问题
C．在“转基因”的过程中，必须用到工具酶
D．转基因技术成果已进入人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用
B　[目前科学家对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解相当有限，再加上转移的基因虽然是功能已知的基因，但不少却是异种生物的基因，因此可能会引起安全性问题，B错误。]
2．下面关于生物武器的叙述，错误的是(　　)
A．世界各国都应当禁止在任何情况下生产、储存和发展生物武器
B．生物武器利用致病菌、病毒、生化毒剂、干扰素及重组致病菌等形成杀伤力
C．生物武器传染性强、作用范围广，应严格禁止
D．消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面
B　[干扰素为细胞因子，非生物武器，B错误。]
考查生物技术的伦理问题
3．(2021·房山区高三模拟)为有效防范由各类生物因子、生物技术误用滥用等引起的生物性危害，生物安全已纳入国家安全体系。以下选项中会给我国带来生物安全风险的是(　　)
A．将新冠患者的血浆采集后注射到危重患者体内
B．试管婴儿通过基因筛查技术阻断遗传疾病的遗传
C．利用生物技术改造的工程菌获得大量的抗生素
D．克隆技术可应用到器官移植但不能进行人体克隆
A　[新冠患者的血浆中可能含有病毒，采集后是不可以直接输入到任何人身体里的，输入到危重患者身体里存在安全隐患，与题意相符，A正确；试管婴儿可以通过基因筛选技术来阻断遗传疾病的遗传，因此经过一定的技术手段可以避免安全风险，与题意不符，B错误；利用生物技术改造的工程菌获得大量的抗生素已经投入生产，一般不会带来生物安全风险，与题意不符，C错误；克隆技术可以克隆器官，但是不可以进行人体克隆，这样可以避免影响伦理道德，与题意不符，D错误。]
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(6)(选择性必修3 P106)生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
2.结论语句
(1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(2)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(7)(选择性必修3 P93)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
(8)(选择性必修3 P94)对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(9)(选择性必修3 P103)理性看待转基因技术，最重要的是，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(10)(选择性必修3 P108)我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
1．(2020·江苏高考)生物学实验常呈现“五颜六色”的变化。下列实验中溶液颜色变化的叙述正确的是(　　)
A．在新鲜的梨汁中加入斐林试剂，混匀后在加热条件下由无色变成砖红色
B．在厌氧发酵的果汁中加入酸性重铬酸钾溶液，混匀后由蓝色变成灰绿色
C．在DNA溶液中加入二苯胺试剂，混匀后在沸水浴条件下逐渐变成蓝色
D．在氨基酸溶液中加入双缩脲试剂，混匀后逐渐变成紫色
C　[斐林试剂为蓝色，在新鲜的梨汁中加入斐林试剂，混匀后在加热条件下由蓝色变成砖红色，A错误；厌氧发酵时果汁中有酒精生成，在厌氧发酵的果汁中加入酸性重铬酸钾溶液，混匀后由橙色变成灰绿色，B错误；在DNA溶液中加入二苯胺试剂，混匀后在沸水浴条件下逐渐变成蓝色，C正确；蛋白质和多肽中含有肽键，与双缩脲试剂可发生作用，产生紫色反应，但氨基酸中不含有肽键，不能与双缩脲试剂发生紫色反应，D错误。]
2．(2021·广东选择性考试)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(下图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高生产率。
回答下列问题：
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有______________________(答出两种即可)。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有____________________(答出两种即可)。
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备____________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有_____________。
(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________________。在分子水平上，可以通过改变______________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
[解析]　(1)获得目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成等方法。(2)蛋白酶可分解蛋白质，但不会分解DNA；蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性，因此在制备高质量的DNA模板时，去除蛋白可采用酶解法或高温处理。(3)将大肠杆菌作为基因工程的受体细胞时，首先应用Ca2＋处理，使其成为能吸收外界DNA的感受态细胞。检测目的基因是否成功表达出酶蛋白可采用抗原—抗体杂交技术。(4)酶的作用条件有适宜的温度、pH等，温度过低，酶的活性会降低，温度过高、强酸或强碱的情况下，酶的活性会降低甚至失活，依据题图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系，这4种酶的最适反应条件不同，会导致可溶性淀粉的分解效率降低。可通过蛋白质工程实现对酶特性的改造和优化，在分子水平上，改变酶相应基因的碱基序列，从而改变酶蛋白的结构，最终实现优化酶特性的目的。
[答案]　(1)从基因文库中获取、人工合成　(2)酶解法(使用蛋白酶进行水解)、高温处理　(3)感受态　抗原—抗体杂交技术　(4)可溶性淀粉的分解效率降低　酶相应基因的碱基序列
3．(2020·江苏高考改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基与5′ 磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；耐高温的DNA聚合酶的作用是催化________________。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物 ①5′ AACTATGCGCTCATGA 3′②5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′③5′ AGAGGCTACGCATTGC 3′④5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′ AACTATGCG┈┈AGCCCTT 3′
B．5′ AATTCCATG┈┈CTGAATT 3′
C．5′ GCAATGCGT┈┈TCGGGAA 3′
D．5′ TTGATACGC┈┈CGAGTAC 3′
[解析]　(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′ 羟基和5′ 磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′ TCATGAGCGCATAGTT 3′(引物④)和5′ GCAATGCGTAGCCTCT 3′(引物②)。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT ，3′端序列应为 TTAA，B正确。
[答案]　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
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