资源简介

(共19张PPT)
首创动物组织体外培养法
体细胞核移植成功
创立单克隆抗体技术
分离和培养小鼠胚胎干细胞
获得诱导多能干细胞
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
动物细胞工程的发展历程
首例胚胎移植成功
发现哺乳动物精子获能现象
试管家兔诞生
胚胎分割移植成功
克隆羊多莉诞生
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
动物细胞工程
动物细胞培养概念
动物细胞培养：从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖。
培养对象：胚胎或幼龄动物的细胞较成体的细胞更易培养
动物细胞培养是动物细胞工程的的基础。
原理：细胞增殖（有丝分裂）
一、动物细胞培养
胚胎或幼龄动物组织（生命力旺盛，易于培养，增殖能力强）
一、动物细胞培养的条件
+
血清
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
一般使用液体培养基，也称为培养液
动物细胞：
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。
1.营养
①适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以_____________为宜；
②适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为________ ；
③适宜的渗透压：
定期更换培养液，以便清除代谢物
①培养液、培养用具：灭菌处理；
②无菌操作；③适量添加抗生素
一、动物细胞培养的条件
36.5±0.5℃
7.2-7.4
④气体环境
气体组成及作用：
O2：细胞代谢所必需；CO2:维持培养液的pH
培养环境：置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
维持细胞正常的形态和功能
二、动物细胞培养过程
小组合作
仔细阅读教材P44-45及动物细胞培养过程示意图，完成以下重要名词解释？
1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞呢？可用什么方法？
2.体外培养动物细胞有哪些类型？
①细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
②分散有利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
①悬浮生长
②贴壁生长
二、动物细胞培养的过程
3.什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
4.什么是原代培养和传代培养？
5.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
①贴壁生长：需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
①原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养；
②传代培养：分瓶后的细胞培养
①悬浮生长类：直接用离心法收集
②贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
一
二、动物细胞培养过程
用机械法 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
原代培养
在培养皿或培养瓶内
加培养液制成细胞悬液
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
④接触抑制
细胞分裂受阻
解决
传代培养
分瓶
培养
取动物组织
分散成单个细胞
②制成细胞悬液，分瓶培养。
①收集细胞
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
①营养物质缺乏、②代谢废物积累、③细胞密度过大等
1.为什么要进行分瓶传代培养？
悬浮细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质减少等因素而分裂受阻
贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
2.两种“培养” 中胰蛋白酶处理的对象是什么？
①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。
②第二次：贴壁细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
3.正常细胞能否一直传代培养下去？
不可以
一般传至10代后就不易传下去，细胞保持细胞正常的二倍体核型
传至10-50代左右时，增殖缓慢，甚至停止，其遗传物质没有发生变化。这一阶段的细胞称为细胞株继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，朝着等同于癌细胞的方向发展，这一阶段的细胞称为细胞系，细胞系的遗传物质一定改变了
二、动物细胞培养过程
1.为什么要将动物组织块分散成单个细胞，制成细胞悬液？
细胞所需营养容易供应，其代谢废物容易排出；
在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。
思考讨论
2.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
说明细胞间的物质主要是蛋白质
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性
3.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？
细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，胰蛋白酶会把细胞消化掉。
因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。
动物细胞培养过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
新植株
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
动物细胞培养与植物组织培养的比较
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
一定条件下，能分化成其他类型的细胞，是细胞内少数还保留分裂、分化能力的细胞。
三、干细胞培养及其应用
干细胞：
①胚胎干细胞（ES细胞）：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
2.分类：
特点：体积小、细胞核大、核仁明显。取自早期胚胎。也叫做全能干细胞。
1.概念：
②成体干细胞：存在于成体组织或器官内中，包括骨髓中的造血干细胞，神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞
一般认为，成体干细胞具有组织特性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完核个体的能力。
（1）概念：通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
2.诱导多能干细胞（iPS细胞）
（2）获取方法：①将特定基因或特定蛋白导入细胞；
②用小分子化合物诱导形成。
（3）诱导多能干细胞优点：①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
干细胞应用面临的问题存在着导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用
(4)缺点：
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
拓展与应用
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结
课堂练习
1.动物体内细胞能够维持正常的生命活动是因为机体给细胞提供了适宜的条件，在体外培养细胞时也需要满足类似条件。下列有关体外培养动物细胞的说法，错误的是( )
A.培养动物细胞时，CO2的作用主要是维持培养液的pH
B.在培养瓶中，大部分细胞悬浮在培养液中生长增殖
C.与老龄动物的细胞相比，幼龄动物的细胞更易于培养
D.在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集
B
2.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是( )
A.动物细胞培养需要的气体主要有CO2和O2，目的是维持细胞呼吸对气体的要求
B.原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长减缓停滞
C.传代培养时，少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，其遗传物质发生了改变
D.动物细胞培养过程中会出现接触抑制现象
A
3.如图所示是某动物细胞培养时，培养液中活细胞和死亡细胞密度统计结果，下列相关叙述错误的是( )
A.实验中要控制胰蛋白酶溶液浓度和处理时间，以免损伤细胞
B.培养液中应适当加入青霉素、链霉素，以避免杂菌污染
C.曲线bc段变化的主要原因是培养液中营养物质不足及有害代谢产物积累
D.培养至第6天时，新产生的细胞数等于死亡细胞数
D

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