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(共40张PPT)
1.2基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建（核心）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因:主要是指编码蛋白质的基因, 也可以是一些具有调控作用的因子。
一、目的基因的获取
　 目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。
　 例如，与生物抗性相关的基因、与优良品相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒性相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。
1、目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库
基因文库
基因组文库(包含生物的全部基因）
部分基因文库（cDNA文库）
（1）从基因文库中获取目的基因。
2、获取方法
①什么叫基因文库？
通过对受体菌的培养而储存基因
基因文库的构建模式图
基因组文库
基因组文库的构建
生物的全部基因
cDNA文库的构建
从基因组文库中获得的目的基因和从cDNA文库中获得的目的基因一样吗？
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。
转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。
非编码区
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
②如何从基因文库中得到所需要的基因？
依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能基因在染色体上的位置
基因的转录产物mRNA
基因翻译产物蛋白质等特性。
原理：DNA双链复制
反应过程：
1.加热至90～95 ℃ 目的基因DNA解链；
2.冷却至55～60 ℃，引物结合到互补DNA链;
3.加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始互补链的合成。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术—聚合酶链式反应
前提：
条件：
场所：
结果：
PCR扩增仪
一段已知目的基因的核苷
酸序列，以便合成引物
原料：四种脱氧核苷酸
引物：一对引物
酶：热稳定DNA聚合酶
(Taq酶）
模板：DNA的两条链
温度控制
以指数方式扩增，即2n
细胞外（PCR扩增仪）
（3）人工合成法
条件：基因比较小，核苷酸序列已知
方法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
二、基因表达载体的构建——核心
1、目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
②使目的基因能表达和发挥作用
2、过程：
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。
2）用同种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
基因表达载体的构建——核心
质粒
DNA分子
一个切口
两个黏性末端
两个切口
获得目的基因
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同种 限制酶
（ 或产生相同 黏性末端的不同限制酶）
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
e、复制原点
注意:目的基因必需插入在启动子和终止子之间
必答
2.基因表达载体的构建:
启动子、终止子和起始密码子、终止密码子比较:
结构方面：
(1)启动子、终止子是基因表达载体上的具有特殊结构______片段
(2)起始密码子、终止密码子是_____上的三个相邻碱基。
功能方面：
启动子、终止子分别是驱动和终止_____；
起始密码子、终止密码子分别是驱动和终止_____
____上的三个相邻碱
基。
DNA
mRNA
转录
翻译
★寻根问底
将生物的所有的DNA直接导入受体细胞不是更简单吗？如果这么做，结果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物,不好检测与筛选,同时也无法增强目的基因的表达水平,也不能确定目的基因产物的存在部位。
(三)将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞：
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌等。
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法（最常用的方法）
——（双子叶或裸子植物）
a.农杆菌特点：
能在自然条件下感染双子叶植物和祼子植物，对单子叶植物无感染能力；
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体DNA上。
2.农杆菌转化法分析:
b、转化过程:
（2）基因枪法（单子叶植物常用）
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道发
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
2.将目的基因导入动物细胞
方法:显微注射技术
受体细胞：受精卵
操作程序:
提纯含目的基因表达载体
取受精卵（受体细胞）
显微注射
移植到子宫
受精卵发育
新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。
第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
原核生物常作为受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少
方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞法
(三)将目的基因导入受体细胞
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
①检测转基因生物DNA上是否插
入了目的基因
方法：DNA分子杂交
工具：放射性同位素标记的目的基因做探针
结果：显示杂交带
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法： 分子杂交
方法：抗原-抗体杂交
工具：放射性同位素标记的目的基因做探针
结果：显示杂交带
结果：显示杂交带
　　除分子的检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，一个抗虫或抗病基因导入植物细胞后，需要做抗病或抗虫的接种实验，以确定植物是否具有抗性以及抗性的程度。
　　有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
3.目的基因的检测与鉴定的方法:
(四)目的基因的检测与鉴定——总结
1.作为基因工程的运载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子,终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是:
(1) 生物之间进行基因交流,只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
(2) 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录；
(3) 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
(4) 为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他调控元件,如增强子等；
(5) 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因,如绿色荧光蛋白基因等。
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？
根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。
如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。
需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
(4)培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取β-珠蛋白。
(1)从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。
(2)将cDNA序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因等组件,构建成一个表达载体。
(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

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