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(共36张PPT)
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
章首
怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？
提取
抗虫基因
棉花细胞
苏云金芽孢杆菌
(有抗虫特征)
普通棉花
(无抗虫特征)
(含抗虫基因)
棉花植株
(有抗虫特征)
培育抗虫棉的简要过程
基因工程实例：
目的基因（P76)：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
项目 具体内容
别名
操作对象
原理
操作水平
结果
分子水平
概念
基因工程
基因重组
获得符合人们需要的新的生物类型和生物制品
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因
重组DNA技术、转基因技术
1
限制性核酸内切酶--“分子手术刀”
2
DNA连接酶--“分子缝合针”
3
基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”
重组DNA技术的基本工具
氢键
磷酸二酯键
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
①磷酸二酯键
②氢键
简图：
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
③
④
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.来源
2.作用
3.结果
4.种类
主要从原核生物中分离纯化
1.来源
①识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；
2.作用
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
EcoRI 限制酶
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的___________。切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
限制酶
②断开磷酸二酯键
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
SmaI 限制酶只能识别 序列，切割 和 之
间的 切开，切割后产生 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
SmaI 限制酶
限制酶
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
主要从原核生物中分离纯化
1.来源
①识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
2.作用
形成黏性末端或平末端
3.结果
②断开磷酸二酯键
4.种类
EcoRI 限制酶和SmaI 限制酶
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或__________的核苷酸组成。
6
4
8
其他数量
识别系列
动脑思考：
1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物中的限制酶可以切割外源DNA，但对自身的DNA不起作用，起到保护自身的目的。破坏外源DNA，保护自我
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
如EcoRI 限制酶识别GAATTC，而细菌缺乏此序列
经过长期的进化，含有某种限制酶的细菌，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样尽管细菌中含有 某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，还可以防止外源DNA的入侵。
原核生物DNA分子中不存在限制酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
拓展思维：
1.要想从一个DNA分子中获得某个特定的基因需要有几个酶切位点？
产生几个末端？
2
4
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
使用EcoRⅠ酶剪切目的基因
识别序列GAATTC
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
A
G
C T T A
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
拓展思维：2.把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
1.作用
2.种类
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
02
DNA连接酶——“分子缝合针”
类型
来源
功能
相同点
差别
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和
平末端(效率较低)
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
DNA连接酶作用示意图：
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
E·coli DNA连接酶的缝合作用
T4 DNA连接酶
既可以“缝合”DNA互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但效率较低。
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
旁栏思考：
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键
DNA聚合酶作用示意图：
归纳总结
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
1.作用：
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中。
（2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制
载体的作用
载体的
必要条件
载体的种类
①能够在受体细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将外源基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对外源基因进行大量复制
①细菌的质粒
②病毒：噬菌体、动植物病毒等。
载体：
03
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒：
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制并带着插入的目的基因一起复制
1、来源：质粒主要存在于细菌和真菌体内。
2、本质：独立于拟核或细胞核外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
3、有一个至多个限制酶切割位点，并含有一些抗生素抗性基因（如图）,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，这些基因可以作为鉴定和筛选重组DNA的标记基因。
4.其他载体
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
知识梳理
基因工程
的工具
限制酶
①主要存在于原核生物中
②具有专一性(识别序列)
③切开DNA分子的磷酸二酯键
④产生黏末端或平末端
DNA连接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶
T4 DNA连接酶
质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
载体
具备的
条件
①能在宿主细胞中自我复制
②并稳定存在
③具一种至多种限制酶切点
④具标记基因
DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理：
1．提取DNA的原理
2．鉴定DNA的原理
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。（分离提取DNA）
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（溶解提纯DNA）
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
二、材料用具
1.选材：
注意：
DNA的粗提取与鉴定
二、材料用具
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用,用棕色瓶保存。鉴定时需沸水浴加热5分钟，溶液的蓝色的深浅与溶液中DNA含量的多少相关。
DNA的粗提取与鉴定
——滴入NaCl溶液中，使浓度下降至0.14mol/L，析出DNA
28
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
方法一：在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500 r/min的转速下离心5 min，取上清液。
2.去除杂质—
1.破碎细胞——
洋葱
研磨液
上清液
上清液
三.方法步骤
思考：
（1）过滤能否用滤纸代替纱布？
（2）第一次过滤后DNA在沉淀中还是上清液中？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，最终影响提取的DNA量。
上清液
29
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
3.DNA的析出—
预冷的酒精
白色丝状物
方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
方法二：将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
（3）析出时为什么要选用预冷的酒精溶液？
可抑制核酸水解酶的活性，抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀；有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
（4）搅拌时需要如何操作？
应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。
（5）还有什么方法可以代替冷却的酒精析出DNA？
离心后取沉淀物。
4．DNA的鉴定
试管编号 对照组 实验组
步骤1
步骤2
步骤3
步骤4
实验现象
实验结论
2 mol/L的NaCl溶液
2 mol/L的NaCl溶液
不进行任何处理
加丝状物或沉淀
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
沸水浴5 min
沸水浴5 min
溶液不变蓝色
溶液逐渐变成蓝色
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
取上
清液
充分
研磨
纱布过滤
95%冷酒精
离心
离心
丝状物
沉淀物
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氨键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
一、概念检测
练习与应用
C
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D.用来识别特定基因的DNA探针
一、概念检测
练习与应用
A
二、拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分了？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
(1) 哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端
二、拓展应用
练习与应用
二、拓展应用
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如,，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用

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