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人教版（2019）高二生物选择性必修三导学案
第2节 基因工程的基本操作程序
学习目标：1.简述基因工程的基本操作程序。
2．掌握获取目的基因的方法。
3．熟悉目的基因导入受体细胞的方法。
4．了解农杆菌转化法。
5．会进行目的基因检测和鉴定方法的比较。
学科素养：1.生命观念：对基因工程的基本程序有整体的认知，形成结构和功能相统一的观点。
2．科学思维：结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
3．科学探究：能复述PCR技术的原理和基本过程，了解扩增目的基因的方法。
知识点一 目的基因的筛选与获取
自主梳理
1．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的__________。
(2)____________的构建。
(3)将目的基因导入________。
(4)目的基因的____________。
2．目的基因
(1)目的基因：用于__________等的基因。主要是指____________的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①较为有效的方法：从相关的________和________的基因中进行筛选。
②认识基因结构和功能的技术方法：________技术、________数据库、________工具。
3．获取目的基因的途径
(1)________目的基因。
(2)构建基因文库获取目的基因。
(3)________获取目的基因。
4．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR是________________的缩写。
(2)PCR原理：________________。
(3)PCR条件：一定的缓冲溶液、________、分别与两条模板链结合的________、4种脱氧核苷酸和________________酶。
(4)每次循环的过程：变性→复性→延伸。
①变性：加热至90 ℃以上时，________________。
②复性：冷却至____℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：加热至72 ℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)特点：上一轮循环的产物作为下一轮反应的________，每一次循环后，目的基因的量可以________，即成________形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
(6)鉴定：常用____________来鉴定PCR的产物。
答案：
1．(1)筛选与获取　(2)基因表达载体　(3)受体细胞(4)检测与鉴定
2．(1)改变受体细胞性状或获得预期表达产物　编码蛋白质　(2)①已知结构　功能清晰　②DNA测序　遗传序列　序列比对
3．(1)人工合成　(3)PCR
4．(1)聚合酶链式反应　(2)DNA半保留复制　(3)DNA模板　2种引物　耐高温的DNA聚合　(4)①双链DNA解聚为单链　②50～60　③DNA聚合酶　(5)模板　增加一倍　指数　(6)琼脂糖凝胶电泳
[互动探究]
1．(生命观念)PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。
提示：不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物是人工加入的一小段DNA。
2．(科学思维)判断PCR是否需要解旋酶和DNA聚合酶两种酶，并说明判断的理由。
提示：不需要解旋酶。理由：PCR中解旋是通过控制温度实现的，当温度上升到90 ℃以上时，DNA的双螺旋结构被打开。需要DNA聚合酶。理由：能将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，但该酶需耐高温。
3．(科学思维)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。
提示：每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于耐高温的DNA聚合酶发挥作用。
4．(科学思维)结合下图分析PCR过程中DNA链复制的方向是怎样的。
提示：DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
归纳提升
1．PCR反应的过程
2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较
比较项目 PCR技术 DNA复制
区别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化
场所 细胞外(在PCR扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内)
酶 耐高温的DNA聚合酶(Taq聚合酶) DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件
合成对象 DNA片段或基因 DNA分子
联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化 ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
3.关于PCR的3点思考
(1) PCR过程中的引物：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。
(2)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
(3)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第3轮循环才会产生完整的目的基因。
针对训练
1．基因工程的操作对象是“目的基因”。下列关于“目的基因”的说法，正确的是(　　)
A．“目的基因”都有自我复制能力
B．“目的基因”都是指能合成相应蛋白质的基因
C．我们可以根据相应的表达产物，从基因文库中寻找“目的基因”
D．反转录得到的“目的基因”与通过相关蛋白质推测出来的“目的基因”碱基序列相同
答案：C　
解析：目的基因通常不具有自我复制能力，A错误；目的基因可能是能合成相关的蛋白质的基因，如胰岛素基因，也可能是调控因子，B错误；我们可以根据目的基因的碱基序列、功能、表达产物等信息，从基因文库中寻找目的基因，C正确；反转录得到的目的基因与通过相关蛋白质推测出的目的基因碱基序列不一定相同，D错误。
2．下列关于PCR的说法，错误的是(　　)
A．PCR是体外复制DNA的技术
B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C．Taq DNA聚合酶具有热稳定性
D．PCR利用的是DNA双链复制原理
答案：B　
解析：PCR是体外复制DNA的技术，A正确；PCR过程中不只需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料，还需要缓冲液、Taq聚合酶等，B错误；Taq DNA聚合酶具有热稳定性，耐高温，C正确；PCR利用DNA双链复制原理，对DNA进行扩增，D正确。
知识点二　基因表达载体的构建和将目的基因导入受体细胞
自主梳理
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中________，并且可以________给下一代。
(2)使目的基因能够________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．将目的基因导入受体细胞
(1)导入植物细胞①____________
a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液________子房中。
b．在植物受粉后的一段时间内，剪去柱头，将________滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入囊胚。
②农杆菌转化法
a．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染________植物和________植物；农杆菌的Ti质粒上的________能够整合到所侵染细胞的_____上。
b．转化方法：将目的基因插入农杆菌_________中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)导入动物细胞
①常用方法：________法。
②常用受体细胞：________。
(3)导入微生物细胞
①方法：用________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
答案：
1．(1)稳定存在　遗传　(2)表达
2．启动子　上游　转录　终止子　下游　转录　标记　目的基因
3．(1)①花粉管通道法　a．直接注入　b．DNA溶液②a.双子叶　裸子　T DNA　染色体DNA　b．Ti质粒的T DNA　(2)①显微注射　②受精卵　(3)①Ca2＋
[互动探究]
1．(生命观念)一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？
提示：用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。
2．(科学思维)启动子、终止子与起始密码子、终止密码子有哪些不同？
提示：①位置上的区别：启动子和终止子位于DNA上。起始密码子和终止密码子位于mRNA上。
②作用上的区别：启动子：启动基因转录。终止子：决定转录的停止。起始密码子：决定翻译的开始。终止密码子：决定翻译的结束。
3．(科学思维)为什么在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上？
提示：Ti质粒上的T DNA也称为可转移DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
4．(科学思维)植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
归纳提升
1．基因表达载体的构建过程
(1)用同一种限制酶或产生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和质粒，使其产生相同末端。
(2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：
2．启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密 码子
本质 有特殊序列结构的DNA片段 有特殊序列结构的DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 基因上游 基因下游 mRNA首端 mRNA 尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 终止转录 翻译的起始点 终止翻译
3.受体细胞的选择
(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
4．农杆菌转化法分析
(1)构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。
(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
(3)由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。
5．目的基因导入受体细胞的方法
受体 细胞 方法 说明 特点
植物 细胞 农杆菌 转化法 将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达 经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物
植物 细胞 花粉管 通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创的一种方法
动物 细胞 显微注 射法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物 将目的基因导入动物细胞最为有效的方法
微生物 细胞 Ca2＋处 理法(感 受态细 胞法) 用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 简便、经济、有效
针对训练
1．某抗虫大白菜是运用转基因技术把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因DXT转移到大白菜细胞中培育而成的，这一过程中要进行基因表达载体的构建。根据所学知识推断，作为基因表达载体应具备的结构有 ( )
A．目的基因、启动子
B．目的基因、启动子、终止子
C．启动子、目的基因、终止子、标记基因
D．起始密码子、目的基因、终止密码子、标记基因
答案：C　
解析：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因DXT是目的基因，将目的基因插入载体质粒后，要想目的基因得到成功表达，还需要在目的基因前插入启动子，在目的基因后插入终止子，此外为了便于筛选出含有目的基因的受体细胞，还要求运载体上有标记基因。因此，作为重组载体应具备的结构有目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
2．我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，下列对此认识正确的是(　　)
A．不必构建重组载体就可以直接导入
B．此方法可用于转基因植物
C．受体细胞只能是植物的卵细胞
D．此方法一定不能取代农杆菌转化法
答案：B　
解析：要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，A错误；花粉管通道法只适用于转基因植物的培育，B正确；花粉管通道法的受体细胞一般为受精卵细胞，而不是卵细胞，C错误；农杆菌转化法一般适用于双子叶植物和裸子植物，而花粉管通道法一般适用于绿色开花植物，故有时可取代农杆菌转化法，D错误。
知识点三　目的基因的检测与鉴定
自主梳理
1．分子水平的检测
(1)通过________等技术检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中。
(2)通过分子杂交技术等技术检测目的基因是否转录出了________。
(3)检测目的基因是否翻译出相应蛋白质，通常用抗体进行________________。
2．个体生物学水平的鉴定
(1)通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花________________________。
(2)通过相应病原微生物感染受体生物来确定相应抗病基因是否赋予了受体生物抗病特性以及抗性的程度。
答案：
1．(1)DNA分子杂交　(2)mRNA　(3)抗原—抗体杂交
2．(1)抗虫特性以及抗性的程度
[互动探究]
1．目的基因的检测与鉴定中，分子水平的鉴定包括哪些内容？
提示：目的基因的检测与鉴定在分子水平包括目的基因是否插入受体DNA，目的基因是否转录出mRNA和目的基因是否翻译出蛋白质三个层次。
2．如何检测目的基因是否翻译出了蛋白质？
提示：提取转基因生物的蛋白质，以相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现杂交带说明目的基因表达出相应蛋白质。也可进行个体生物学水平的鉴定。
3．对于转基因抗虫或抗病植株，在个体生物学水平的鉴定包括哪些内容？
提示：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，在个体生物学水平上需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。
归纳提升
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体细胞DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
3．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质的分配是不均匀的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b细胞在进行减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
(3)在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
针对训练
1．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．可用含有目的基因的DNA探针检测基因是否转入受体细胞
B．目的基因是否转录和翻译的检测方法是DNA分子杂交技术
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病鉴定可用于确定转基因生物是否具备相关性状
答案：B　
解析：可采用DNA分子杂交技术，将含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，检测目的基因是否转入了受体细胞，A正确；目的基因是否转录出了mRNA的检测方法是分子杂交技术，检测目的基因是否翻译出蛋白质，可从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品，B错误，C正确；目的基因的检测还可在个体生物学水平进行，如让虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性，D正确。
2． 下列关于“基因探针”的叙述，正确的是(　　)
A．基因探针既可以检测某一特定的DNA，也可检测RNA
B．基因探针是一小段具有随机脱氧核苷酸序列的单链DNA
C．基因探针既可以检测核酸分子，又可以检测特定的蛋白质
D．基因探针以其双链形式发挥作用，其放射性和荧光标记便于检测
答案：A　
解析：基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少具备以下两个条件：①应是单链，若为双链，必须先进行变性处理；②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。基因探针可以根据碱基配对的原理检测核酸分子，但不能检测特定的蛋白质，综上分析，A符合题意，B、C、D不符合题意。
[要语必背]
1．在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。它主要是指编码蛋白质的基因。
2．PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。
3．PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度等。
4．PCR扩增的过程：变性→复性→延伸。
5．基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，基因表达载体由启动子、目的基因、标记基因、终止子等构成。
6．将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，此外，还有花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞时，常用大肠杆菌作为受体细胞，应用的方法是Ca2＋处理法。
7．目的基因的检测与鉴定是实施基因工程的第四步。分为分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。分子水平的检测包括通过PCR等技术检测受体生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA，利用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出蛋白质。
巩固练习
1． PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(　　)
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过控制反应温度来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．②③
C．①③ D．②④
答案：C　
解析：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA，①正确；PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶，②错误；PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过控制反应温度来实现的，③正确；④PCR过程中，DNA不依靠解旋酶解旋，而是利用高温解旋，然后以单链DNA为模板进行复制，④错误。
2．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是(　　)
A．将目的基因导入植物细胞时，农杆菌转化法适用于大多数单子叶植物
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
答案：A　
解析：将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法适用于双子叶植物和裸子植物，A错误，D正确；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，B正确；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，C正确。
3．依据蛙的血红蛋白基因序列制成DNA探针，对样品进行检测，以下不能与探针形成杂交分子的是(　　)
A．蛙红细胞的DNA
B．蛙白细胞的mRNA
C．蛙红细胞的mRNA
D．蛙白细胞的DNA
答案：B　
解析：蛙红细胞中有血红蛋白基因，其DNA可与该DNA探针进行杂交，A正确；蛙白细胞中血红蛋白基因不表达，所以该细胞中的mRNA不能与探针形成杂交带，B错误；蛙红细胞中血红蛋白基因会转录形成相应mRNA，该mRNA能与探针形成杂交带，C正确；蛙白细胞的DNA中含血红蛋白基因，能与探针形成杂交带，D正确。
4．随着研究的不断深入，PCR方法被不断改进，PCR需要模板DNA、引物、脱氧核糖核苷酸和DNA聚合酶、ATP等条件，其简要过程如图所示。请分析回答下列有关问题：
(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是________。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在环境温度的不同，在PCR中先用94 ℃高温处理的目的是________________。
(2)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。
(3)DNA子链复制的方向是________，这是由于_____。
(4)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了乙肝病毒(DNA病毒)，你认为可以用PCR扩增血液中的________。
答案：(1)DNA半保留复制　使DNA变性(或使DNA的两条链解开)　(2)211－2
(3)5′端到3′端　DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子
(4)病毒核酸
解析：(1)PCR技术的原理是DNA半保留复制；在PCR中先用94 ℃高温处理的目的是使DNA变性(使DNA的两条链解开)。(2)PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入211－2个引物。(3)由于DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子，故DNA子链复制的方向是5′端到3′端。(4)PCR就是聚合酶链式反应，用于扩增DNA序列，所以可以用PCR扩增血液中病毒核酸便于检测。

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