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人教版（2019）高二生物选择性必修三导学案
第1节 重组DNA技术的基本工具
学习目标：1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2．掌握基因工程中作为载体需要具备的条件。
3．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
学科素养：1.生命观念：通过理解重组DNA技术所需的三种工具的作用，建立结构与功能相适应的观念。
2．科学思维：运用模型与建模、批判性思维、创造性思维的方法，理解重组DNA技术所需的三种工具的作用。
知识点一　基因工程的概念和发展
自主梳理
1．基因工程的概念
基因工程又叫作____________。基因工程是指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2．基因工程的诞生和发展
时间 理论基础和相关技术的发展
1944年 艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验，不仅证明了遗传物质是________，还证明了DNA可以在________的不同个体之间转移
1953年 沃森和克里克建立了DNA________结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说
1958年 梅塞尔森和斯塔尔证明了DNA的________复制。克里克提出________法则
1961年 尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的________
1967年 科学家发现，在细菌拟核DNA之外的________有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移
1970年 科学家发现了第一个________________(简称限制酶)。之后多种________、DNA________和________酶被相继发现
1972年 伯格构建了第一个____________分子
1973年 基因工程正式问世
1977年 桑格等发明DNA序列分析的方法。________的问世为体外合成DNA提供了方便
1982年 第一个基因工程药物——________________被批准上市
1983年 科学家采用________________培养出第一例转基因烟草，此后，基因工程进入迅速发展阶段
1985年 穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段
2013年 张峰利用最新的基因组编辑技术——CRISPR技术编辑了哺乳动物基因组
答案：
1．重组DNA技术　转基因
2．DNA　同种生物　双螺旋　半保留　中心　密码子　质粒　限制性内切核酸酶　限制酶　连接酶　逆转录　体外重组DNA　DNA合成仪　重组人胰岛素　农杆菌转化法
[互动探究]
1．(生命观念)为什么几乎所有生物的DNA分子都可以进行DNA拼接？
提示：几乎所有生物的DNA分子都具有相似的成分和结构，即都是由4种脱氧核苷酸形成规则的双螺旋结构。
2．(科学思维)为什么一种生物的基因在其他生物体内也能正常表达？
提示：(1)所有生物共用一套遗传密码，这为一种生物的基因在其他生物体内正常表达提供了可能。
(2)基因是控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性，这为目的基因在受体细胞中的独立表达提供了可能。
针对训练
1．下列叙述符合基因工程概念的是(　　)
A．在细胞内将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性
B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
答案：B　
解析：基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物新的遗传特性，A项错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。
2．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列不是这一先进技术的理论依据的是(　　)
A．所有生物共用一套遗传密码
B．基因能控制蛋白质的合成
C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
答案：D　
解析：题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A项不符合题意；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B项不符合题意；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C项不符合题意；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D项符合题意。
知识点二　DNA重组技术
自主梳理
1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自________。
(2)特点：具有________。
①识别双链DNA分子的某种________________。
②切割特定核苷酸序列中的________。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________。
(4)结果：产生________________。
(5)应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的________不同，切割位点________，说明限制酶具有________。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)种类
种类 比较 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 ________ ________
特点 只能连接________ 既可以连接黏性末端，又可以连接________
(2)作用：形成____________。
(3)结果：形成____________。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)种类：质粒、________、动植物病毒等。
(2)常用载体——________
①本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有________能力的____________分子。
②质粒作为载体所具备的条件
a．能________；
b．有限制酶________；
c．具有________。
(3)作用
①作为运输工具，将目的基因____________。
②质粒携带目的基因在受体细胞内________。
答案：
1．(1)原核生物　(2)专一性　①特定核苷酸序列　②特定位点　(3)磷酸二酯键　(4)黏性末端和平末端　(5)碱基序列　不同　专一性
2．(1)大肠杆菌　T4噬菌体　黏性末端　平末端　(2)磷酸二酯键　(3)重组DNA分子
3．(1)噬菌体　(2)质粒　①自我复制　环状双链DNA　②a.自我复制　b．切割位点　c．标记基因
(3)①导入受体细胞　②大量复制
[互动探究]
1．(生命观念)图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
图1
图2
请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点；EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶作用的结果分别是什么？
提示：EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。EcoR Ⅰ限制酶将DNA切割成黏性末端，Sma Ⅰ限制酶将DNA切割成平末端。
2．(科学思维)质粒作为目的基因的载体，其本质是什么？所有质粒都是载体吗？为什么？
提示：DNA。不是。作为载体必须具备一定的条件，条件不具备，则不能作为载体。
3．(科学思维)载体在基因工程中的作用是什么？
提示：作为运输工具，将外源(目的)基因导入受体细胞，携带外源(目的)基因在受体细胞内大量复制。
4．(科学思维)分析质粒载体结构模式图，回答下列问题：
大肠杆菌及质粒结构模式图
(1)质粒上氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？
(2)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备的条件是什么？
(1)提示：作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(2)提示：有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点。
归纳提升
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，能够切割特定序列中的特定位点。
(2)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系
(1)区别
作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
(2)两者的关系
3．限制酶的选择技巧
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ； ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ； ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端； ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
4.标记基因标记的原理
(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
原理如图所示：
5.基因工程中的载体具备条件
(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
[特别提醒]
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
[知识拓展]
1．不同生物的DNA分子能拼接起来的原因
(1)不同生物的DNA分子的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸。
(2)不同生物的双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)不同生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。
2．外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状的原因
(1)基因是控制生物体性状的结构和功能的基本单位，具有相对独立性。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
针对训练
1．目前市面上许多疫苗是应用基因工程技术生产的，在基因工程的实验过程中，把目的基因和运载体连接起来的是(　　)
A．核酸酶 B．限制性内切核酸酶
C．DNA连接酶 D．运载体
答案：C　
解析：核酸酶属于水解酶，能够将核苷酸链水解成核苷酸，不能把目的基因和运载体连接起来，A错误；限制性内切核酸酶用于切割DNA，获取目的基因和运载体，不能把目的基因和运载体连接起来，B错误；DNA连接酶能够将DNA片段连接起来，目的基因与运载体被限制酶切割后都相当于DNA片段，故基因工程中将目的基因与运载体连接起来的工具是DNA连接酶，C正确，D错误。
2．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是(　　)
A．不能将单个脱氧核苷酸加到某DNA片段末端
B．一种DNA连接酶只能连接某一特定序列的DNA片段
C．重新构建两条DNA单链上碱基之间的氢键
D．只能作用于有黏性末端的片段，不能将平末端的DNA片段之间进行连接
答案：A　
解析：DNA连接酶能连接两个脱氧核苷酸片段，形成磷酸二酯键，不能将单个核苷酸加到某DNA片段末端，A正确；DNA连接酶能将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键，B错误；DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，C错误；DNA连接酶分别为E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，这两种酶都能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，其中T4 DNA连接酶还可以连接平末端，D错误。
3．质粒是基因工程中最常用的载体，有关质粒的说法正确的是(　　)
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案：C　
解析：病毒的成分是核酸和蛋白质，没有质粒，A错误；细菌的基因主要存在于拟核中，少量存在于质粒中， B错误；质粒是小型的环状DNA分子，存在于拟核(或细胞核)外，C正确；质粒在基因工程中起运载体的作用，D错误。
知识点三　DNA的粗提取与鉴定
自主梳理
1．实验原理
(1)提取原理
①DNA不溶于________，某些蛋白质溶于________。
②DNA在不同浓度的________溶液中溶解度不同。
(2)鉴定原理：在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现________。
2．实验流程
答案：
1．(1)①酒精　酒精　②NaCl
(2)二苯胺　蓝色
2．纱布　4　酒精溶液　95%　粗提取的DNA　NaCl　二苯胺试剂　沸水　不变蓝　变蓝色
[互动探究]
1．(科学探究)鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。
提示：哺乳动物的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。
2．(科学探究)实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
3．(科学探究)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
归纳提升
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
针对训练
1．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案：A　
解析：兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌是为了获得较完整的DNA分子，B正确；在预冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，如果用热的95%酒精会提高DNA的溶解度，不能完全使DNA沉淀，C正确；将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D正确。
2．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破以获取富含DNA的滤液
B．常温下香蕉匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
C．在粗提取过程中两次加入蒸馏水的作用不同
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热后会变蓝
答案：A　
解析：兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；常温下香蕉匀浆中有些酶类会影响DNA的提取，B正确；实验中先后两次加入蒸馏水的作用不同，分别是使血细胞涨破、降低NaCl溶液浓度使DNA析出，C正确；DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热后会变蓝，D正确。
[要语必背]
1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀”：切割DNA的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。限制酶切割的是双链DNA分子每一条链中特定部位的磷酸二酯键，大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，如EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶等，DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”：DNA连接酶是一种能够将两个DNA片段连接起来的酶。一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coli DNA连接酶，其只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段；另一类是从T4噬菌体中分离出来的T4 DNA连接酶，其既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率相对较低。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”：在基因工程中通常利用质粒作为载体，除此之外，也可用噬菌体、动植物病毒等。
巩固练习
1．下列关于基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．基因工程的生物学原理是基因突变
B．基因工程的常用工具酶有限制酶、DNA连接酶和运载体
C．整个过程都在细胞外进行
D．通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状
答案：D　
解析：基因工程的生物学原理是基因重组，A错误；基因工程的常用工具酶有限制酶和DNA连接酶，B错误；基因工程的一部分过程发生在生物体外，也有一部分过程发生在生物体内，C错误；基因工程是现代生物技术的核心，能按照人们的意愿，定向创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，D正确。
2．下列关于限制性内切核酸酶(限制酶)的叙述，正确的是(　　)
A．限制酶主要来源于原核生物
B．限制酶的识别序列均由6个核苷酸组成
C．限制酶作用于两条核苷酸链之间的磷酸二酯键
D．限制酶可识别RNA分子的某种特定核苷酸序列
答案：A　
解析：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A正确；大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶识别序列由4、5或8个核苷酸组成，B错误；限制酶作用于每一条核苷酸链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；限制酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，D错误。
3．质粒和病毒是常用的基因工程的运载体，原因之一是(　　)
A．含蛋白质，容易将目的基因整合到受体细胞的染色体上
B．能够自我复制，且能保持连续性
C．含RNA的病毒能够直接指导蛋白质的合成，因而更常用作运载体
D．具有环状结构，能够携带目的基因
答案：B　
解析：质粒是一种小型环状DNA分子，不含蛋白质，A错误；质粒和病毒都能在宿主细胞中自我复制，并保持连续性，B正确；不是所有的RNA病毒在宿主细胞中都能指导蛋白质的合成，C错误；质粒具有环状结构，能够携带目的基因，但不是作为基因工程载体的必备条件，病毒不一定具有环状结构，D错误。
4．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的DNA片段，其末端类型通常有________和________。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
该酶识别的序列为________________________，切割的部位是________________。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是_
_________________________________________。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外，________和____________也可作为载体。
答案：(1)黏性末端　平末端
(2)　G和A之间的磷酸二酯键
(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同
(4)T4　E．coli　
(5)噬菌体　动植物病毒
解析：(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶Y切割，说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E.coli DNA连接酶。

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