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(共43张PPT)
专题2 微生物的培养与应用
课题1 微生物的实验室培养——实验操作
1、阐述配制固体培养基的方法
2、掌握平板划线法和稀释涂布平板法的操作方法
学习目标
学生自学（5分钟）
自学课本P16-P20上半部分，思考这部分讲了哪些知识点，哪些是重点，标出疑惑
自学指导一（4分钟）
根据P16-P17实验操作完成下列问题
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的大致过程有哪几部？
2.牛肉膏蛋白胨有什么样的特点，称取时要注意什么？
3.溶化过程中需要注意什么？
4.灭菌时应注意什么？
5.怎样进行倒平板操作？
6.完成课本P17下面的讨论。
实验操作
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
（二）纯化大肠杆菌
大肠杆菌
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
将上述物质溶解后，添加水，定容至1000mL
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1.计算：
根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量
牛肉膏：0.5g
蛋白胨：1.0g
NaCl：0.5g
琼脂：2.0g
电子天平
2.称量：
准确称取各成分
注意：称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖
牛肉膏：0.5g
蛋白胨：1.0g
NaCl：0.5g
琼脂：2.0g
3.溶化：
①加水加热溶化牛肉膏
牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，溶化后取出称量纸
②加入蛋白胨和氯化钠，玻棒搅拌溶解
③加入琼脂，不断搅棒熔解
④用蒸馏水定容到100mL
目的：防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
4.灭菌：
将配置好的培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅内灭菌15～30min
4.灭菌：
将配置好的培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅内灭菌15～30min
将培养皿用旧报纸包紧，放入干热灭菌箱内灭菌2h
5.倒平板：
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
讨论1：你用什么办法来估计培养基的温度？
用手触摸锥形瓶，感觉温度刚好不烫手
倒平板操作
1
1.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞
2
2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
讨论2：为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
3
3.用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10-20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
4
4.等待平板冷却凝固（大约5-10min）后，将平板倒过来放置
讨论3：平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结出水珠，凝固后的培养基表面的温度较高，将平板倒置，既可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可避免培养基中水分过快地挥发
讨论4：在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
不能，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，造成污染
注意：倒平板时，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位
6.无菌检查：
将灭菌的培养基放入37℃的恒温箱中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底
自学指导二（4分钟）
根据P18下半部分至P20上面两行纯化大肠杆菌完成下列问题
1.什么是菌落？
2.什么是平板划线法？
3.平板划线的操作过程是怎样的？
4.完成P18讨论题
5.什么是稀释涂布平板法？
6.稀释和涂布平板的操作步骤分别是怎样的？
（二）纯化大肠杆菌
1.微生物的分离与纯化：
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程，称为微生物的分离与纯化
利用固体培养基，将混杂细菌分散或稀释成单个细胞，使其繁殖成单个菌落
2.微生物接种方法：
①平板划线法
②稀释涂布平板法
工具：接种环
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面。在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。
平板划线法:
平板划线操作
土壤稀释液
用力不能过大
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
平板划线操作
区域一
区域二
区域三
区域四
区域五
平板划线操作
思考：平板划线操作的整个过程，是如何实现纯化大肠杆菌的？
平板划线操作
区域一
区域二
区域三
区域四
区域五
菌种多
菌种少
菌种减少
菌种减少
菌种减少
菌种最少
问题讨论
（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种
（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落。
　　1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101~106的顺序编号。
系列稀释操作
2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
系列稀释操作
3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰1~2cm处
涂布平板操作
自学指导三（2分钟）
根据P20完成下列问题
1、解决P20结果分析与评价
2、怎样对菌种进行保存？
四、菌种的保藏
甘油冷冻管藏法
1、临时保藏——频繁使用的菌种：
接种到固体斜面培养基上，在合适的温度下培养，当菌落长成后将试管置于4℃冰箱中保存
2、长期保存：
以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上
将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混合后，放在－20℃的冷冻箱中保存
小结:

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