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(共43张PPT)
课题3 血红蛋白的提取和分离
学习目标
1、掌握血红蛋白的提取和分离方法
2、熟悉提取和分离的操作过程
学生自学
自学课本P64—P70，思考这部分讲了哪些知识点，哪些是重点，并标出疑惑点
血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
血红蛋白
两个α－肽链
两个β一肽链
四个亚铁红素基团
血红蛋白的特点：
自学指导一
根据课本P64--65，完成下列问题
1 、分离生物大分子的基本思路是什么？
2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？
3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？
4 、为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？
5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质 ？
一、蛋白质提取和分离原理
蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质：
形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。
提取分离方法
凝胶色谱法
凝胶电泳法
1、原理：
2、材料-
小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；
多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
凝胶
(一)凝胶色谱法
（分配色谱法）：
根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法
分子量 大 小
直径大小
运动方式
运动速度
运动路径
洗脱次序
蛋白质分离和提取的原理
大于凝胶颗粒孔隙
直径，被阻挡在颗
粒的外面
小于凝胶颗粒孔
隙直径，可以进
入颗粒内部
垂直向下移动
垂直向下移动，
无规则扩散进
入颗粒内部
较快
较慢
较短
较长
先从凝胶柱洗脱
出来
后从凝胶柱洗脱
出来
3、具体过程
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
自学指导二
根据课本P65-66，完成下列问题
1、什么是缓冲液？
2、缓冲液的作用是什么？
3、缓冲液是如何配制的？
4、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？
5、什么是电泳？其原理是什么？有哪些类型？
1 、什么是缓冲液？
2、 缓冲液的作用是什么？
（二）、缓冲溶液-
在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠， NaH2PO4/Na2HPO4等
能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。
洗脱剂
3、 缓冲液是如何配制的？
4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？
通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
磷酸缓冲液
在本课题中使用的缓冲液是:__________ ,其目的是:
利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
2 .原理：
(三)电泳
1.电泳的概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离
的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及
分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移
速度，从而实现样品中各种分子的分离。
凝胶电泳原理示意图
在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。
(三)电泳
3.类型:
琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
4 .聚丙稀酰胺凝胶电泳分离过程：
自学指导三
根据课本P66--70，完成下列问题
1、蛋白质提取和分离分为哪几步？
2、样品处理和粗分离包括哪几步？
4、说说凝胶色谱的操作过程？
3、红细胞洗涤的目的是什么？血红蛋白的释放中蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？分离后的层析现象？
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
（1）样品处理：
包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。
（2）粗分离：
透析除去分子较小的杂质。
（3）纯化：
通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。
（4）纯度鉴定：
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
↓
↓
↓
（一）样品处理
血液
血浆
水 分
固体物质：
血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
血细
胞
白细胞
血小板
红细胞
（最多）
血红蛋白
（90％）
两个α－肽链
两个β一肽链
四个亚铁红素基团
血液的成分
（一）样品处理及粗分离
1、红细胞的洗涤：
（2）目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
（1）步骤：
柜式离心机
初次离心后的结果
3次洗涤后的结果
在蒸馏水和甲苯作用下搅拌，红细胞破裂释放
2 、血红蛋白的释放：
蒸馏水的作用是
加入甲苯的作用是
充分搅拌的目的是
使红细胞大量吸水胀裂
溶解红细胞的细胞膜
加速红细胞的破裂
搅拌器转子
磁力搅拌器
搅拌器正在工作
3.分离血红蛋白
分离过程
红细胞
混合液
中速离心
10min
离心管
滤纸
过滤
脂类物质
烧杯
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 无色透明的甲苯层
脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层
血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
20mmol/L磷酸缓冲液
1mL
1mL
4、透析（粗提取）：
装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
利用透析袋透析
透析过程
（二）纯化－－凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作：
2.凝胶色谱柱的装填：
3.样品的加入和洗脱
（二）凝胶色谱操作
1、凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
如P68图5-19
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的
凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋
白质分离不彻底。
材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液
装填:
2.凝胶色谱柱的装填：
步骤 操作要求
①
②
③
④
⑤
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
洗涤平衡
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
装填悬浮液
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
根据色谱柱体积计算凝胶用量
色谱柱垂直固定在支架上
配制悬浮液
计算称量凝胶
固定色谱柱
注意：
1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间
的空隙。
3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气
泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物
质的分离效果。
2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
装配好的凝胶柱如图5-21
3.样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
3.样品的加入和洗脱
开始进行层析
收集得到的纯化后的蛋白
知识总结
血红蛋白的提取和分离
蛋白质分子的差异性
凝胶色谱法
原 理
分离过程
凝胶电泳法
缓冲溶液
组 成
作 用
蛋白质的
提取分离
样品处理
粗 分 离
纯 化
纯度鉴定
当堂练习
1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。
A分子的大小 B相对分子质量的大小
C带电荷的多少 D溶解度
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。
A温度 B pH
C渗透压 D氧气浓度
B
B
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。
A相同 B相反 C相对 D相向
4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。
A血红蛋白 B肌红蛋白
C肌动蛋白 D肌球蛋白
B
A
5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。
A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。
A. NaCl B.甲苯
C.蒸馏水 D.柠檬酸钠
C
D
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ）
A无色透明的甲苯层
B脂溶性物质的沉淀层
C血红蛋白的水溶液
D其他杂质的暗红色沉淀物
C
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是
A 弄清各种蛋白质的空间结构
B 弄清各种蛋白质的功能
C 弄清各种蛋白质的合成过程
D 获得高纯度的蛋白质
巩固
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少 B 分子的大小
C 肽链的多少 D 分子形状的差异
4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是
A 调节pH B 维持红细胞的能量供应
C 防止微生物生长 D 防止血液凝固

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