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第2章 细胞工程
第1节 植物细胞工程
一 植物细胞工程的基本技术
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
细胞工程
原理和方法：
操作的水平：
目的：
分类：
细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科。
细胞器、细胞或组织水平
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品。
植物细胞工程、动物细胞工程
植物细胞工程
1902年，哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
1958年，斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960年，科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964年，古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971年，卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现，之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
细胞的全能性
1.概念：
细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化为其他各种细胞的潜能
韧皮部细胞
细胞团
根或芽
幼苗
胡萝卜植株
脱分化
再分化
2.具有全能性的原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质
3.不同细胞全能性的大小：
分化程度低的＞分化程度高的
细胞分裂能力强的＞细胞分裂能力弱的
①体细胞全能性：
②不同细胞的全能性：
受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞
③不同生物的细胞全能性：
植物细胞＞动物细胞
4.体现全能性的要点：
起点：经分裂和分化后的细胞
终点：完整个体或其他各种细胞
5.不体现全能性的实例：
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
叶原基
芽原基
原因：
在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性表达
①利用菊花茎段培养获得试管苗；②利用胡萝卜的韧皮部细胞培养获得胡萝卜幼苗；③受精卵发育成个体；④通过花药离体培养，获得单倍体幼苗。⑤蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂；⑥胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞
6.植物细胞表达出全能性的条件：
离体
一定的营养物质和激素
适宜的环境条件（温度，PH，无菌）
思考：
1.是不是所有的活细胞都具有全能性？
2.种子发育成植株体现了全能性了吗？
3.细胞具有的全能性一定能表现出来吗？
不是；
例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。
没有；
植物种子种的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
不一定；
例如动物的体细胞。
植物组织培养技术
植物组织培养是指离体的植物器官，组织和细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件下，诱导其形成完整植株的技术。
离体
人工配制的培养基，适宜的培养条件
植物组织培养
前提：
条件：
结果：
诱导其形成完整植株
离体培养的植物器官，组织或细胞被称为外植体
体细胞
个体
无性生殖
生殖细胞
个体
有性生殖
植物组织培养技术 菊花的组织培养
1.理论依据：
植物细胞的全能性
2.培养过程：
接种外植体
诱导愈伤组织
一定的激素，营养
脱分化
脱分化
已经分化的细胞，失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞
愈伤组织
不定形的薄壁组织团块（具有分裂和分化能力）
1.脱分化过程中细胞的活动：细胞分裂（有丝分裂）
2.脱分化过程中一般不需要光照
3.愈伤组织的代谢类型：异养需氧型
思考：若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？
愈伤组织中不含有叶绿体；
培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
再分化
愈伤组织重新分化成芽，根等器官
1.再分化过程中细胞的活动：细胞分裂，细胞分化
2.再分化过程中需要光照（诱导叶绿素的合成）
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
脱分化
再分化
植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂，脱分化和再分化的关键激素
生长素与细胞分裂素的比值
比值高
促进根分化，抑制芽形成
比值低
促进芽分化，抑制根形成
比值适中
促进愈伤组织形成
口诀：生根，分芽，等愈伤
3.材料用具：
幼嫩的菊花茎段
容易诱导形成愈伤组织
培养基（P116MS培养基）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）；
蔗糖的作用：
提供能量，调节渗透压
4.方法步骤：
（1）消毒
①双手和超净工作台台面:
用酒精擦拭
②外植体:
流水冲洗→酒精消毒30s→立即用无菌水清洗2～3次→次氯酸钠溶液处理30min→立即用无菌水清洗2～3次。
（2）外植体切段
将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中，用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5 ～ 1 cm长的小段。
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
（3）接种外植体
注意：
接种时注意外植体的方向，不要倒插！
（4）脱分化
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
注意：
该过程一般不需要光照，有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
（5）再分化
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上→长出芽后→将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
注意：
注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根；该过程每日需要给予适当时间和强度的光照！
（6）移栽培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
5.结果分析与评价：
（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。
用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能有：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等；
（2）从刚接种的外植体到长出愈伤组织需经历多少天？
2周左右
植物体细胞杂交技术
1.概念
番茄
马铃薯
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为两种生物之间存在着天然的生殖隔离
2.过程
（1）去除细胞壁
方法：
利用纤维素酶和果胶酶去除这层细胞壁，获得原生质体
纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？
使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常
去壁
去壁
A原生质体
B原生质体
去壁
去壁
A原生质体
B原生质体
融
合
正在融合的原生质体
再生
新壁
再生出细胞壁
（2）原生质体间的融合（关键环节）
诱导方法
物理法：
电融合法，离心法
化学法：
聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
完成融合标志
再生出细胞壁
原理
细胞膜的流动性
思考：获得的所有细胞一定是需要的杂交细胞吗？
不一定，有三类：
①未融合的细胞
②两两融合的细胞
③多细胞融合体
若只考虑两两融合
AA
AB
BB
筛选
AB
A
B
去壁
去壁
A原生质体
B原生质体
融
合
正在融合的原生质体
再生
新壁
再生出细胞壁
（3）植物组织培养
脱分化
再分化
移栽
原理
植物细胞的全能性
过程
脱分化，再分化
植物体细胞杂交完成的标志
培育成新植物体
去壁
去壁
融
合
再生
新壁
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合技术
植物组织培养技术
A细胞
A原生质体
B细胞
B原生质体
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
愈伤组织
杂种植株
3.总结
原理：
生殖方式：
分裂方式：
可遗传变异类型：
植物细胞的全能性、细胞膜具有一定的流动性
无性生殖。
有丝分裂。
染色体（数目）变异。
AA
BB
AABB
AABB
几倍体？
四倍体
4.概念
植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
白菜—甘蓝
5.意义
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
√
2.科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分
纤维素酶和果胶酶
3."番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能像在原植株细胞内实现有序表达，因此不能按照人们的要求；表现出亲本所有的性状。

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