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第2节 动物细胞工程
（动物细胞融合）
第二章 细胞工程
动物细胞融合
1、概念：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2、原理：
细胞膜具有一定的流动性
3、结果：
形成杂交细胞。（融合后形成的原来两个或多个细胞的遗传信息）
4、意义：
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
物理法：离心法、电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)融合法
生物法：灭活病毒诱导法
6、融合方法：
动物细胞融合
特有
5、过程：
细胞膜融合
细胞核融合
细胞质融合
完成的标志
灭活病毒诱导法
灭活：指用物理或化学手段使病毒失去感染能力（不感染细胞），
但是并不破坏病毒的抗原结构（诱导细胞融合）。
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
植物体细胞杂交vs动物细胞融合
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
抗体
1、抗体是由什么细胞产生的？
浆细胞（效应B细胞）
2、抗体是如何产生的？
蛋白质
3、抗体的化学本质是什么？
4、抗体主要分布在哪里？
血清
5、一种浆细胞能产生几种抗体？
一种
1抗原
传统抗血清
（所有抗体混合）
免疫
传统抗体的制备
缺陷：产量低、纯度低，特异性差。
动物体内
抗原
反复注射
浆细胞
抗体
B淋巴细胞
增殖分化
１）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上
２）每个B淋巴细胞（浆细胞）只分泌一种特异性的抗体
科学家发现：
单
克 隆
抗 体
如何获得大量、单一的抗体？
体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖
需解决问题：
遗憾：
如何解决这一难题？
一个B淋巴细胞
B淋巴 细胞群
单一抗体
大量繁殖
（克隆）
单克隆抗体
单个B细胞进行无性繁殖产生的化学性质单一、特异性强的抗体
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
一种B淋巴细胞
（只分泌一种特异性抗体）
杂交瘤细胞
特点：既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
单克隆抗体
注射抗原
多种B淋巴细胞
用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
细胞融合
多种杂交细胞
进行诱导融合后，培养基中会有几种细胞？
思考1
5种
骨髓瘤+B细胞
骨髓瘤+骨髓瘤
B细胞+B细胞
B细胞(未融合)
骨髓瘤(未融合)
注射抗原
多种B淋巴细胞
用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合
多种杂交细胞
用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体）
选择培养基
1．DNA的合成有D途径和S途径两种途径，其中D途径是在叶酸的辅助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途径是利用酶，催化次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）生成相应的核苷酸。
2．已知氨基蝶呤（A）是叶酸的拮抗物；实验所用的骨髓瘤细胞缺乏S途径中的酶。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
（叶酸）
S途径
（酶）
D途径（叶酸）
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
HAT培养基--了解
注射抗原
多种B淋巴细胞
用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合
多种杂交细胞
用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体）
选择培养基
(第一次筛选)
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞(阳性)
多轮次的克隆化培养和抗体检测
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交技术
克隆化培养和抗体检测
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
96孔板培养和筛选
检测原理：抗原和抗体能够特异性结合
注射抗原
多种B淋巴细胞
用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合
多种杂交细胞
用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体）
选择培养基
(第一次筛选)
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞(阳性)
多轮次的克隆化培养和抗体检测
注射到腹腔
体外培养
体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖
从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体
单克隆抗体
总结
注射特定抗原的目的是获得什么细胞？
B淋巴细胞
第一次筛选的目的？如何筛选？
筛选原理是？
筛选出杂交瘤细胞；
选择培养基；
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞的特点是？
既能迅速大量繁殖，又能产生抗体
总结
第二次筛选的目的？如何筛选？
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞；
选择抗体检测呈____性的杂交瘤细胞
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测
抗体和抗原能特异性结合
阳
抗体检测原理是？
总结
如何获取大量所需的杂交瘤细胞？
在体外条件下大规模培养或注射到小鼠腹腔中
如何获得单克隆抗体？
从细胞培养液或小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗体发生特异性结合，并且可以大量的制备。
单克隆抗体的优点
单克隆抗体制备过程的原理
细胞膜具有一定的流动性和细胞增殖
单克隆抗体应用
（1）诊断试剂——最广泛应用
在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。
抗（人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
（2）用于治疗疾病和运载药物
单克隆抗体应用
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
抗体
药物
接头
细胞凋亡
ADC被细胞吞噬
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
单克隆抗体应用（视频）
练习
犬细小病毒(CPV)单克隆抗体(Cpv McAb)可抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制，进而杀灭幼犬体内病毒。下列相关叙述，错误的是(　　)
A．在Cpv、McAb的制备过程中用到了动物细胞培养和动物细胞融合技术
B．给幼犬注射CPV后，CPV抗体检测呈阳性，说明发生了体液免疫反应
C．经选择性培养基筛选出来的杂交瘤细胞即可直接生产Cpv McAb
D．对杂交细胞培养时，需要无菌无毒环境，且温度、气体环境等要适宜
C
练习
关于动物细胞融合的说法错误的是( )
A.动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的多核细胞称为杂交细胞
B.动物细胞融合己成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段
C.常用于诱导动物细胞融合手段有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等
D.细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
A
关于动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的比较,下列叙述合理的是 (　　)
A.均可使用PEG、电激或灭活病毒诱导细胞融合
B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离
C.两者都可以体现细胞的全能性
D.在适宜条件下，均可发育成完整个体
B
练习
练习
如图2-2-6为单克隆抗体的制备流程示意图。下列叙述正确的是(　　)
图2-2-6
A.甲是从已免疫的小鼠脾脏中获得的致敏T淋巴细胞
B.①表示将骨髓瘤细胞去核后进行细胞融合
C.乙为融合细胞，同时具有细胞甲和骨髓瘤细胞的特性
D.②表示筛选能产生特异性抗体的细胞
D
练习
B
如图所示为杂交瘤细胞的制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT-),在HAT选择培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是 (　　)
A.可用灭活的病毒诱导B淋巴细胞与
骨髓瘤细胞融合
B.两两融合的细胞都能在HAT选择培
养液中生长
C.杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产
D.细胞膜的流动性是细胞融合的基础

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