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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
微生物
类群
原生生物：
原核生物:
真菌:
病毒:
如酵母菌、霉菌等
单细胞的动植物
如草履虫、硅藻等
无细胞结构
真核细胞
如乳酸菌、大肠杆菌、醋酸菌等
如噬菌体等
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
酸奶
_____________，_______________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
从社会中来
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基的配制
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
高压蒸汽灭菌
固体培养基
3）将需要的微生物分离出来
——微生物的纯培养
微生物在其表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。
1.2.1微生物的基本培养技术
本节聚焦:
什么是培养基？如何配制？
什么是无菌技术？
怎样进行酵母菌的纯培养？
一
培养基的配制
1.培养基的用途有哪些？
2.培养基的必备营养成分有哪些？
3.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。
4.培养基的种类有哪些？
任务一：阅读教材P9-10，分析培养微生物的培养基种类和营养构成。
一
培养基的配制
资料1：100g马铃薯中含有80g水、2g蛋白质、16g碳水化合物，还有无机盐等。
资料2：下表为1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养基组分 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
Nacl 5g
H2O 定容至1000ml
水
碳源、磷酸盐和维生素等
氮源和维生素等
无机盐
问题：比较上述两种培养基的成分共同点，说出培养基的必备营养成分有哪些？
牛肉膏
蛋白胨
2.培养基的必备营养成分:
水、碳源、氮源、无机盐等。
⑴碳源
无机碳源：
有机碳源：
CO2、NaHCO3
糖类、牛肉膏
⑵氮源
无机氮源：
有机氮源：
N2和NH3
尿素、蛋白胨
自养微生物
（提供碳元素）
（提供氮元素）
异养微生物
1.培养基的用途：
培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
P10旁栏思考1：为什么培养基需要氮源？
氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。
一
培养基的配制
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
特殊营养物质、pH、氧气
一、培养基的配制
3.培养基的“个性定制”：
一
培养基的配制
④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。
例如：①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；
②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
C
自养微生物
学以致用
1.下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是（ ）
A. 大肠杆菌 B. 根瘤菌 C. 硝化细菌 D. 乳酸菌
2.下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A. 是碳源的物质不可能同时是氮源
B. 凡碳源都提供能量
C. 除水以外的无机物只提供无机盐
D. 无机氮源也能提供能量
D
如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源
C错，如CO2，可作自养型微生物的碳源，而NaCl则只能提供无机盐
固体
培养基
液体
培养基
有 无 琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
4.培养基种类：
①按物理状态来分：可分为液体培养基、固体培养基等。
一
培养基的配制
②按功能来分：可分为选择培养基、鉴别培养基等。
在培养基中加入某种物质或缺失某种物质，使需要的微生物生长，而阻止或抑制不需要的微生物生长
选择培养基：
例2：不加氮源的选择培养基：分离出固氮菌；
例3：不加含碳有机物的选择培养基：分离出自养型微生物
例1：用选择培养基选择出
抗氨苄青霉素的微生物：
一
培养基的配制
4.培养基种类：(按功能来分)
鉴别培养基：
在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同类型微生物
伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
（菌落呈深紫色，并带有金属光泽）
一
培养基的配制
4.培养基种类：(按功能来分)
二
无菌技术
任务二：阅读教材P10，比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异。
比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
灭菌
较为温和
强烈
部分微生物
全部微生物
一般不能
能
防止杂菌污染包括:
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
二、无菌技术
任务二：阅读教材P11，说出消毒和灭菌的主要方法。
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种环、接种针、涂布器、试管口、瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、无菌水
高压蒸汽灭菌锅内,
100 kPa,温度121 ℃
接种室、接种箱，超净工作台
防止杂菌污染的措施：
P10旁栏思考2：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
有效避免操作者自身被微生物感染。
实验前：
对操作空间、操作人员消毒
对所用器皿、接种用具和培养基灭菌
操作时：
在超净工作台上并在酒精灯火焰附近无菌区操作
避免已灭菌处理材料再次污染
二
无菌技术
以下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
高压蒸汽灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
化学消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
【对点训练】
3.关于灭菌和消毒的不正确的理解是( )
A．消毒和灭菌实质上是相同
B．灭菌是指杀死一定环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
C．接种环用烧灼的方法灭菌
D．实验操作者的双手应消毒，而培养器皿、接种用具和培养基应灭菌
A
学以致用
固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
2.接种和分离方法：
平板划线法和稀释涂布平板法
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
1.原理：
三
微生物的纯培养
3.过程：
配制
培养基
灭菌
倒平板
接种和分离
培养
三
微生物的纯培养
思考：培养基和培养皿的灭菌方法相同吗？
配制
培养基
灭菌
不相同:湿热灭菌,干热灭菌
三
微生物的纯培养
观看视频，回答问题：
1.倒平板时的培养基温度？
2.倒平板要在什么附近进行？
3.倒平板时为什么不能将培养皿完全打开？
2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
配制
培养基
灭菌
倒平板
50℃
酒精灯火焰
防止空气中杂菌污染
可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
三
微生物的纯培养
根据以下问题,观看视频:
1.划线前灼烧接种环目的？
2.为什么接种环待冷却后再进行划线？
3.第二次划线要从什么位置开始划？
配制
培养基
灭菌
倒平板
接种和分离
杀死接种环上可能存在的微生物
以免接种环温度太高，杀死菌种。
从上一次划线的末端开始
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
平板划线法：
划线轨迹
生长情况
三
微生物的纯培养
4.接种和分离酵母菌
平板划线操作全过程
2.在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
【合作探究】请小组讨论以下问题：
3.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
三
微生物的纯培养
4.为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？
将聚集的菌体逐步稀释，以便获得单个菌落。
1.为什么从第二次划线开始，每次划线之前都要灼烧接种环？
杀死上次划线接种环上残留的菌种，使下一次划线时菌种来源于末端
避免残留的菌种污染环境和操作者
若将最后一次划线与第一次划线相连，则无法获得单个菌落。
思考：为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，该培养基无菌落说明培养基没有污染
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
三
微生物的纯培养
5.培养酵母菌
结果分析与评价：
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，如果你观察到了不同形态的菌落，可能是由哪些原因引起的吗？
如果有，说明培养基被杂菌污染。
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
三
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
课堂小结
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
练习与应用
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
练习与应用
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
自养型微生物
例题.右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（2）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
固氮微生物

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