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2.2动物细胞工程(2)
动物细胞融合技术
与单克隆抗体
旁栏思考题P49
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
【答案】病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
一.动物细胞融合技术
1970年，有两位科学家做了一个著名的实验：人—鼠细胞融合的实验。
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
1970年，细胞融合实验
一.动物细胞融合技术
1.概念:使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.原理：细胞膜的流动性。
3.诱导方法：[化学]聚乙二醇(PEG)融合法
[物理]电融合法
[生物]灭活病毒诱导法等
4.结果：形成一个杂交细胞，该细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
与植物原生质体融合的基本原理相同
形成了一个单核细胞
相关信息
1. “灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
1．病毒在生物技术中的应用(1)灭活的病毒能作为诱导剂，不灭活的病毒不能作为诱导剂。(2)病毒在不同过程或操作中的“身份不同”。在免疫调节中病毒属于抗原，在基因工程中可作为载体，在细胞工程中可作为诱导剂。
相关信息
2. 灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
一.动物细胞融合技术
1．意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．应用
生物种类 细胞来源 成功年代
酵母菌-鸡 原生质体-血红细胞 1975年
人-胡萝卜 腹水癌细胞-原生质体 1976年
人-鼠 纤维肉瘤细胞-畸胎瘤细胞 1978年
动物细胞融合成功实例：
种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
1．右图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( )
A．若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合
B．a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现
C．c细胞的形成与a、b细胞细胞膜的流动性无关
D．c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因
解析：选B。a、b细胞如果为植物细胞，则需要去细胞壁，但不需要去分化，A项错误；两细胞融合需要用物理或化学等方法促融，其融合过程体现了细胞膜具有一定的流动性，B项正确，C项错误；融合后的杂交细胞中的基因仍是选择性表达的，不会表达全部的基因，D项错误。
随堂检测
B
二.单克隆抗体及其应用
1.传统抗体的获得及特点
缺点：
产量低、纯度低、特异性差
抗原
反复注射动物
从动物的血清中分离抗体
由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，
1.抗体是由何种细胞产生的？
B淋巴细胞——浆细胞
2.一个B淋巴细胞能产生多种抗体吗？
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
思 考
每一个B淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，特异性强的抗体。
如果利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体。
问题：怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？
特异性抗体
无限增殖
无限增殖
特异性抗体
解决方案
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒大胆设想，设计了一个极富创造性的试验方案：
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
通过实验，他们得到了单克隆抗体。由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
一个B淋巴细胞(产生单一的抗A的抗体)
骨髓瘤细胞能无限增殖
杂交瘤细胞
动物细胞培养技术
动物细胞融合技术
单克隆抗体
既能产生特异性抗体，又能大量增殖的细胞
单克隆抗体制作的流程
注射特定的抗原
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
诱导融合
培养骨髓瘤细胞
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
多种杂交细胞
第一次筛选
用特定的选择培养基
杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
用特定的选择培养基进行筛选:在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
多种B淋巴细胞
思考
1、为什么给小鼠注射特定的抗原？
获得产生相应抗体的B细胞。
2、（只考虑两两融合）融合细胞有几种类型？
3种。BB 、B瘤 、瘤瘤
单克隆抗体制备过程中所提到的B淋巴细胞实际上是浆细胞
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
（可进行多次）
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能与特定抗原结合)
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
体外培养
单克隆抗体
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
多孔细胞培养板
注射到小鼠腹腔内
阳性孔
方法——抗原-抗体杂交法
通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
两次筛选进行比较
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等。
用特定的选择培养基进行筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长。
筛选出融合的杂种细胞
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低。
规模小，产量少。
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高。
【培养杂交瘤细胞的方法比较】
单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
细胞凋亡
ADC的作用机制示意图
①
ADC被细胞吞噬
②
⑤
ADC
抗体
药物
接头
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
思考 讨论
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
【答案】抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
【提示】可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
思考 讨论
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
【提示】单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
二.单克隆抗体及其应用
3．单克隆抗体的优点及应用
(1)优点
①能准确地识别抗原的细微差异。
②与特定抗原发生特异性结合。
③可以大量制备。
二.单克隆抗体及其应用
(2)应用
①作为诊断试剂，如定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
②用于治疗疾病和运载药物。如抗体—药物偶联物(ADC)。
生物导弹＝单克隆抗体＋药物
课堂检测
1.犬细小病毒(CPV)单克隆抗体(Cpv McAb)可抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制，进而杀灭幼犬体内病毒。下列相关叙述，错误的是(　　)
A．在Cpv McAb的制备过程中用到了动物细胞培养和动物细胞融合技术
B．给幼犬注射CPV后，CPV抗体检测呈阳性，说明发生了体液免疫反应
C．经选择性培养基筛选出来的杂交瘤细胞即可直接生产Cpv McAb
D．对杂交细胞培养时，需要无菌无毒环境，且温度、气体环境等要适宜
C
课堂检测
2.关于动物细胞融合的说法错误的是( )
A.动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的多核细胞称为杂交细胞
B.动物细胞融合己成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重
要手段
C.常用于诱导动物细胞融合手段有聚乙二醇、灭活的病毒、电融合法等
D.细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能
A
3.单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶的培养基(HAT)中无法生长；而小鼠B淋巴细胞是正常细胞，在HAT培养基上可正常存活。用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在HAT培养基上存活的细胞是 (　　)
A. 骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞
B. B淋巴细胞之间形成的融合细胞
C. 骨髓瘤细胞与B淋巴细胞之间形成的融合细胞
D. B淋巴细胞
C
4.科学家将经过羊红细胞免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，并能分泌单克隆抗体。羊红细胞和B淋巴细胞在该实验中分别属于 (　　 )
A.癌细胞和记忆淋巴细胞
B.抗原物和浆细胞
C.特定抗体物和记忆淋巴细胞
D.癌细胞和浆细胞
B
谢 谢 观 看！

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