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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
1、微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
一、微生物的基本培养技术
2、实验室培养微生物条件
① 提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基
② 确保其它微生物无法混入
——无菌技术
难以用肉眼观察到的微小生物，该如何培养呢？
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质
1、概念：
2、作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢产物
有无 凝固剂琼脂
液体培养基
固体培养基
微生物的分离、鉴定、活菌计数
扩大培养、
工业生产
（一）培养基的配制
3、类型：
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
选择培养基
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
碳源、氮源、水、无机盐
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
无机氮源：
NH4＋、NO3-、N2 、 NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
③无机盐：
提供无机营养；维持pH；调节渗透压
4、培养基成分：
①碳源
来源
功能：
构成细胞的物质和代谢产物；有机碳源可提供碳源和能量
①碳源
来源
功能：
合成蛋白质、核酸等
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
注：满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
举例说明：
培养乳酸菌需要添加维生素
培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或微碱性
培养厌氧微生物时需要提供无氧条件
经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是制作过程中有杂菌混入。
从社会中来
应该对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
1、获得纯净的微生物培养物的关键：
防止杂菌污染
2、防止杂菌污染的方法：
①消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
（二）无菌技术
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
3、无菌的范围：
①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒
②培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
③实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
注意
4、消毒方法：
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min，如：日常生活
②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min，
不耐高温的液体，如：牛奶
③化学药物消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台，杀死物体表面或
空气中的微生物。
①灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
如接种环、接种针、涂布器，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
5、灭菌方法：
耐高温，需保持干燥的物品，如：玻璃器皿 、金属器具
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
如培养基等
注：使用后的培养基必须灭菌后
才能丢弃，以免污染环境。
③湿热灭菌：沸水、流通蒸汽或高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
最有效
高压蒸汽灭菌：
传统发酵通常直接利用原材料中天然酵母菌
工业生产通常使用人工选育的高活性酿酒酵母
如何获得纯种酵母菌？
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物；
1、培养物：
纯培养物：
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
（三）微生物的纯培养
2、步骤：
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等
纯培养：
获得纯培养物的过程就是纯培养。
3、酵母菌的纯培养：
（1）菌落：
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
特征：
大小、形状、隆起程度、颜色等。
（3）获得单菌落的方法：
平板划线法、稀释涂布平板法
（2）单菌落：
将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（4）方法步骤
① 制备培养基
配制培养基
灭菌
包器材
(调pH)
培养基：高压蒸汽灭菌
培养皿：干热灭菌
（4）方法步骤
① 制备培养基
配制培养基
灭菌
(调pH)
倒平板
50℃左右；
酒精灯火焰附近；
冷凝后平板倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不用;防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
思考:
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
既可以防止培养基表面的水分挥发；
又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
② 接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
原理：
“平板划线”实验操作
连续划线法
分区划线法
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
重复实验：
划3个平板
空白对照：
1个不划线
第一区域
第二区域
第三区域
第四区域
第五区域
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③划线后，培养皿倒置培养
注意：
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
思考：
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
③ 培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
思考：
为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
1.培养基的制作是否合格？
2.接种操作是否符合无菌要求？
3.是否进行了及时细致的观察与记录？
培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
结果分析与评价

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