资源简介

(共28张PPT)
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
从社会中来
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
该怎么办呢？
二、微生物的选择培养和计数
实例
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？
水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1、筛选原则：
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
2、实验室筛选微生物原理：
人为提供_______________ 的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2、举例：
分离酵母菌等真菌
分离固氮微生物
分离自养型微生物
②不加碳源
③不加氮源
①加入青霉素
在微生物学中，将允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
1、概念：
（一）选择培养基
④无氧条件
分离厌氧菌或兼性厌氧菌
选择培养基配方的设计
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
尿素的立体结构
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
思考·讨论
尿素的立体结构
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
选择培养基配方的设计
思考·讨论
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
选择培养基配方的设计
思考·讨论
区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
进一步思考：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
选择培养基配方的设计
思考·讨论
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌呢？
【资料1】 通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中一部分，如图1。
【资料2】土壤溶液直接接种到选择培养基上的培养，结果如图2。
图1完全培养基
图2选择培养基
可否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？
×
资料分析
【资料3】当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
资料分析
【资料4】
平板划线法
用平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的吗？为什么？
×
（二）微生物的选择培养
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单菌落。
稀释涂布平板法
1、方法：
稀释涂布平板法
2、原理：
土壤取样
梯度稀释
取菌液滴加到培养基表面
涂布器消毒、灭菌
涂布平板
3、稀释涂布平板法的操作步骤
恒温培养
注：
①铁铲、信封在取样前灭菌
②培养：倒置、30-37℃恒温培养箱、1-2d
③所有操作在酒精灯火焰旁进行
（1）原理：
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
（三）微生物的数量测定
1、稀释涂布平板法
（活菌计数法、间接计数法）
（2）计数标准：
（3）计数结果：
菌落数≈活菌数
①选择30-300个菌落的平板进行计数
②每个稀释度至少对3个平板取平均值
菌落数往往比活菌的实际数目少
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落
（4）结果表示：
用菌落数表示
注：恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
M：代表稀释倍数；
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
例1：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
5、 计算公式：
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1.甲同学____________________________________；
原因是____________________________________。
2.乙同学____________________________________；
原因是____________________________________。
实验操作不合理
未设置重复实验组
结果计算不合理
21与另外两组数值相差太大，应舍去
①血细胞计数板：
②细菌计数板：
常用、快速直观
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
2、显微镜直接计数法
（1）计数工具：
（2）特点：
（3）缺点：
不能区分死菌和活菌→偏大
6.1 细胞的增殖-课件【新教材】人教版（2019）高中生物必修一(共42张PPT)
提出问题:
1、如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
探究·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知识:
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
（1）土壤取样
（2）配制培养基
（3）样品的稀释与涂布平板
（4）微生物的培养与观察
取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
选择培养基 *以尿素为唯一氮源
完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）
实验过程:
①细菌计数一般用104、105、106倍稀释的稀释液
②每个稀释度涂布3个平板
——作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
(平行重复)
（3）样品的稀释与涂布平板
选择培养基
（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
*细菌一般在30-37℃的温度下,恒温培养箱中培养1-2d（平板倒置）
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取数目稳定时的记录作为结果。
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
操作提示:
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染及选择培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的选择培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的基础培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
结果分析与评价
2、你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
结果分析与评价
3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
方法：在培养基中加入酚红指示剂
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
进一步探究
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤 系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种环在固体培养基表面连续划线
接种工具 涂布器 接种环
菌体获取 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
能否用于计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板 不能计数
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以观察菌落特征。

展开更多......

收起↑