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(共39张PPT)
[高考揭秘]
从3年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景，将会收到良好的效果。
① PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理
② 基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景
③ 微生物的选择和鉴别是核心考点，结合基因工程改造近几年命题趋势
④ 细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察。
⑤ 热点考察：新冠检测相关技术，酵母双杂等复杂情景
(题目主要来源：2019-2022年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
第3讲：发酵技术和微生物培养
考法1 传统发酵和发酵工程（后者新教材）
考法2 微生物培养（核心要点/透明和抑菌圈等）
考法3 结合环保背景和基因工程考察
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
1. 传统发酵技术和发酵工程
① 发酵：利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
② 传统发酵技术
微生物来源：天然菌种，或上次的面团、卤汁
形式：固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
特点：一般菌种是多样的，获得的产物一般不是单一的组分
③ 发酵工程与前者不同，其特点是：
考法1 传统发酵技术和发酵工程
食品 菌种 呼吸类型 原理 温度
果酒 酵母菌
果醋 醋酸菌
腐乳 毛霉等微生物 －
泡菜 乳酸菌 －
兼性厌氧
好氧
好氧
厌氧
无氧呼吸产生乳酸
蛋白酶、脂肪酶分解蛋白质、脂肪
糖(酒精)→醋酸
有氧呼吸大量繁殖，无氧呼吸产生酒精
30～35 ℃
18～30 ℃
最适28 ℃
考法1 传统发酵技术和发酵工程
2. 理清“4”种传统发酵食品的技术
[总结题型：各地高考或模拟] 请回答下列有关发酵食品制作的问题：
1) 在传统腐乳制作过程中，所需的微生物来源于_____________________；而现代的腐乳生产是在严格_____的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染。
2) 在泡菜腌制的过程中，最后要向坛盖边沿的水槽中注满水，这一操作的目的是_________________________________________。在泡菜的腌制过程中，要注意控制腌制的条件，如________________________________________等（答出3点即可），若条件不适，容易造成细菌的大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
3) 某同学制作蓝莓果醋时，定时通过充气口充气，原因是____________
____________________________________________________。另一位同学在蓝莓果汁中直接加入某品牌活性酵母，之后先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，这一做法的目的是___________________________________________________。
腌制方式，温度和时间（课本P6）
保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境
空气中的毛霉孢子
无菌
醋酸菌是好氧菌，生产醋酸时需要氧气参与
在有氧条件下，使酵母菌迅速繁殖，数量增加
4) 在蓝莓果酒制作过程中，若制作失败，则在变酸的酒的表面观察到的菌膜是由__________大量繁殖而形成的，其可在缺少糖源时将乙醇变为______，然后变为醋酸。酿苹果酒的过程中，乙醇是在酵母菌细胞的______________形成的，苹果汁中的糖源对酵母菌的作用是___________________________________________________________________________。产醋阶段需要________（填“升高”或“降低”）反应温度。
5) 豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是___________。从大豆到豆豉，大豆中的成分会发生一定的变化，其中，蛋白质转变为________________，脂肪转变为________________________________________________。
醋酸菌
乙醛
氨基酸和肽
脂肪酸和甘油 (本题模型是课本的腐乳)
用于合成酵母菌的细胞物质和一些代谢产物，也是酵母菌的能源物质；
细胞质基质
好氧菌
升高
3. 各项发酵产品控制杂菌的措施
① 无氧发酵时的无氧环境可以抑制___________。
② 乳酸菌和酒精发酵形成的_____________________________抑制杂菌繁殖。
③ 利用酒精或者_______________控制杂菌：如泡菜的制作。
④ 清洗葡萄时要__________________________________
④ 传统发酵装置的改造（下一页PPT）
④ 发酵工程中，__________________都要严格灭菌
好氧菌
酸性环境和缺少氧条件
盐、香辛料
培养基发酵设备
先清洗后除枝梗
考法1 传统发酵技术和发酵工程
[2018·海南节选] 葡萄酒是葡萄汁经酵母菌发酵而成的。酿制葡萄酒的两个简易装置如图所示。甲装置酿制葡萄酒的优点是：
① 不需要开盖放气，减少操作的繁琐；
② 避免了因开盖引起的杂菌污染
[P8“练习与应用·拓展应用3] 改良的方面有哪些？
① 发酵瓶排气管用曲颈管
② 无需开盖出料检测
③ 无需开盖进行放气
④ 使用无菌空气进行醋酸菌的发酵
[2018·海南节选] 3) 某同学若用乙装置进行发酵，并设置两个不同处理组(乙A和乙B)，乙A装置中保留一定量的氧气，乙B装置中没有氧气。在其他条件相同且适宜的情况下，测得一段时间内乙A和乙B中酒精含量的变化趋势及乙A中氧气含量的变化趋势，如曲线图所示。
图中曲线①、②、③依次表示_________________、______________、____________含量的变化趋势。
4) 从细胞呼吸类型看，酵母菌属于____________生物；从同化作用的类型看，酵母菌属于__________(填“自养”或“异养”)生物。
乙A中的氧气
乙B中的酒精
乙A中的酒精
兼性厌氧
异养
—— 看看其他发酵曲线图的分析
[2021西藏统考模拟节选] 3) 下图中能正确表示泡菜中亚硝酸盐含量随发酵时间变化的曲线是___________________________。分析泡菜发酵前期亚硝酸盐含量变化的原因是______________________________________________；
第2～5天亚硝酸盐含量变化的原因是_____________________。
4. 发酵曲线图的分析
B (课本P8有类似图形)
细菌大量繁殖，将泡菜中硝酸盐还原成亚硝酸盐
乳酸菌分解亚硝酸盐，乳酸含量增加，抑制不抗酸微生物繁殖
考法1 传统发酵技术和发酵工程
4. 发酵曲线图的分析
[2022湖北高考] 黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇反应形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
3) 研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测________是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是__________________。
两图中脲酶活力随时间变化的曲线基本一致，而维持pH在6.5不变与pH从6.5降为4.5相比较而言，酶活力值始终要高
pH
[2022湖北高考]
1) 某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是___________，工艺b是_______（填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是____________________。
2)以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。
4) 某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路_____________________________。
酵母菌
消毒
目的是杀死啤酒的中大多数微生物，并延长其保存期
酚红
配置一种选择培养基，筛选出产生脲酶(或EC)的细菌，从细菌中分离得到脲酶，纯化的脲酶进行固定化操作后，在黄酒工艺流程的发酵环节中加入。
[2022·天津静海区] 如图所示为发酵工程生产产品的流程图，据图回答：
1) 若能生产人生长激素的工程菌是通过①培育的，①应该是___________；若高产青霉素菌种是通过②培育的，②应该是__________。
基因工程
诱变育种
2) 根据培养基的用途，可以将它们分为_____培养基和_____培养基。各种培养基的具体配方不同，但一般都含有_________
_________________等营养成分。培养基在使用之前要用_______________________________进行灭菌。
选择
鉴别
碳源、氮
源、水、无机盐
高压蒸汽灭菌法(湿热灭菌)
5. 发酵工程的基本流程（新教材）
考法1 传统发酵技术和发酵工程
3) 整个过程的中心环节是_________，在该时期要随时取样检测培养基中的_________
________________等。同时，要严格控制____
_________________________等发酵条件，因为环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物________的形成。
发酵过程
微生物数
量、产物浓度
溶氧量、pH和温度
代谢物
4) 在发酵过程中要不断搅拌的目的是：①______________；②______________________
_____________________。
5) 如果发酵产品是菌体本身，常常采用____________等方法分离、提纯；如果发酵产品是微生物的代谢物，还要根据产物的性质采取适当的方法分离、提纯。
增加溶氧量
使菌种与培养液充分接
触，提高原料的利用率
过滤、沉淀
考法1 传统发酵技术和发酵工程
[2021广东] 中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为___________，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用_____________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有_____________________________等。（答出两种）
唯一碳源
诱变育种、基因工程育种
抽样检测
2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是___________。（答出两点即可）
3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中_______________________可能是高密度培养的限制因素。
4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌__________________________________。
盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；
pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
—— 其实就是在回答酿酒的模型：酒的传统发酵为什么无需严格灭菌？
氧气（O2或溶解氧）
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
[2021·全国乙卷] 工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程。利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。
3) 在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于________(填“真核”或“原核”)生物；添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是______________________。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是____________________________(答出1点即可)。
　酒精、乳酸、食盐
酒精和二氧化碳
原核
无菌技术 消毒 煮沸消毒法、巴氏消毒法以及使用化学药剂进行消毒
灭菌 对培养基进行灭菌，常采取__________________；
对接种环灭菌采取__________________；
对玻璃器皿灭菌采取__________________
微生物的纯化技术 平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步_________________到培养基的表面
稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的___________，然后将其分别_________到琼脂固体培养基的表面，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落
倒平板操作 待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
1. 微生物培养的核心要点
高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
干热灭菌
稀释分散
梯度稀释
涂布
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
1. 微生物培养的核心要点
① 平板划线法适用于微生物的________，但不能用于微生物的________。
② 稀释涂布平板法常用于____________，而显微镜直接计数不能区分菌体
________。
③ 制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是__________________________。
④ 将1 mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，每种稀释度各在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，6个平板上的菌落数分别为548、472、450、48、47和58。据此可得出每升土壤溶液中的活菌数约为___________个。
纯化
计数
活菌计数
死活
既可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
又可避免培养基表面的水分过快地挥发 （写两句，很多教辅一句而已）
5.1×107
—— 对应要点：为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板计数。
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
[一些变式的规范答题整合]
1) 纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是
____________________________________________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是________________。
接种环灼烧后未冷却（或划线未从第一区域末端开始）
接种环
将聚集的菌落逐步减少以获得单个菌落
2) 为什么稀释倍数高的计算结果往往大于稀释倍数低的结果？
稀释倍数低的组菌液浓度较大，两个或多个细菌形成同一个菌落的概率大
以上其实是常考问题的另类问法：为什么稀释涂布平板计数结果偏小？
当两个或多个细胞连在一起时，最终平板上观察到的只是一个菌落。
2. 微生物分离与计数的课本模型（考察选择培养基和鉴别培养基）
模型应用：
降解尿素（上面2022湖南卷）和
充分利用纤维素（后面2022广东卷）
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
3. 透明圈的问题
[2019·全国Ⅱ] 物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
1) 要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是___。
W
2) 在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择___菌落进一步纯化，选择的依据是______________________
_______________________________________________。
乙
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
3) 土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________________________________
__________________________________________________。
若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，
4) 该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明_____
______________________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________。
缓冲液
缓冲液不能降解W
酶E与天然酶降解W的能力相近
—— 本题虽然有基因工程的背景，但是没有展开
[2022·全国甲卷] 某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。实验所用的培养基成分如下。培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
① 将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
② 液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
1) 实验所用培养基中作为碳源的成分是______。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成_________________________________(答出2种即可)等生物大分子。
石油
DNA、RNA、蛋白质
2) 步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是________。
3) 为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_______________________________________________________________________________________。
菌株 透明圈大小 平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
N0·2n
在平板Ⅰ和平板Ⅱ的甲孔中均滴加A菌液，在平板Ⅰ和平板Ⅱ的乙孔中均滴加等量的B菌液，培养相同时间，
观察透明圈大小(分解石油的能力越强，透明圈越大)
4) 现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是______________________________________________________________________________________________________________________________________
菌株A在无NH4NO3的培养基上可以生长繁殖，
而菌株B在无NH4NO3的培养基上不能生长繁殖，
且菌株A分解石油的能力较强(合理即可)
菌株A
菌株 透明圈大小 平板Ⅰ 平板Ⅱ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
[2022浙江卷] 回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：1) 为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。2) 为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
3) 为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、_________________等技术获得。
3. 透明圈的问题：有时候得染色
无菌水
水浴
杀死不耐热微生物
分离
KI-I2
人工诱变
原生质体融合
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
4. 抑菌圈（必修二P115，教材新增的内容，可以结合考察）
① 利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法。
② 也常用于抗生素分泌菌的分离筛选。工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。
考法2 微生物培养的核心要点 (透明和抑菌圈等)
[2021上海虹口一模] 在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴浸有不同抗生素（浓度相同）的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如下图。以下判断错误的是（ ） A. a处抑菌效果小于b处B. b处的滤纸片没有沥干C. c处抗生素无效D. d为对照
A
[2022河北统考预测] 番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的，具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作为描抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此，发掘新的高效能描抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意义。回答下列问题。1) 进行样本采集及描抗细菌菌株分离纯化时，应采集某地番茄青枯病发病果园中 _________（填“健康”或“患病”）植株根际土壤，在番茄青枯病发病果园中取样的原因是 _____________________________________ 。先称取1 g土壤添加到盛有 _________ 的三角瓶中均匀振荡后，置于恒温水浴15min。经分离培养后，挑取单菌落进行划线纯化。2) 进行描抗细菌的分离筛选时，为比较不同根系微生物纯化菌液对青枯病病原菌的描抗作用效果，科研人员配制了含有青枯病病原菌的平板，在含青枯病病原菌平板上滴加 _______________ ，在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并比较抑菌圈的大小，措抗作用越强则______ _________ 。
健康
拮抗微生物数量多针对性强
无菌水
不同根系菌液
抑制菌圈越大
[2022河北统考预测] 番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的，具有较强的侵染力和破坏力。番茄青枯病可通过以根际促生菌作为描抗微生物抵御青枯雷尔氏菌进行生物防治。因此，发掘新的高效能描抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意义。回答下列问题。3) 通过对描抗细菌产酶活性进行测定，筛选出4株菌株，随后进行青枯病预防实验。现有番茄幼苗、4种菌液、青枯菌菌液、无菌水等。请设计实验比较菌株的预防效果______（写出实验思路）。
将生长状况相同且良好幼苗平均分为 5 等分，标注 1-5 组，
每组设三个平行组。
1 组喷洒无菌水和青桔菌液，2-5 组分别喷洒四种菌液，后喷洒青枯菌菌液，
培养一段时间观察比对生长及患病情况。
[2022广东] 研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
1）研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
1. 结合环保背景的微生物降解
高压蒸汽灭菌
平板板划线
纤维素
考法3 结合环保背景和基因工程考察
2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可）
3）藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是____________________________________________________________________。
4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
耐低温
1. 结合环保背景的微生物降解
[2021青海西宁统考] 土壤中含有丰富的磷资源，其中只有1%左右能被植物吸收利用，其他以无机磷酸盐固体形式存在。解磷细菌可以溶解磷酸盐固体，提高土壤肥力，促进农作物的生长。科研工作者通过分离、培养解磷细菌，制备成颗粒状的菌肥，应用到农业生产中。请回答下列问题：
1）欲从土壤中分离解磷细菌：首先取少量土壤，在以_________________为唯一磷源的__________（填“固体”或“液体”）培养基中进行富集作用，目的是_____________________。
3）农田中施用菌肥比施用化肥更具优势在于_____________（列出两点即可）。
磷酸盐（固体）
液体
增加解磷细菌浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物 !!!
① 微生物菌肥可以在土壤中生长繁殖，持续时间长
② 微生物菌肥长期使用不会造成土壤中化肥的残留与土壤板结
③ 可以将土壤中农作物不能利用的营养元素转变为可利用的形式，保障农作物的生长
考法3 结合环保背景和基因工程考察
2）企业发酵生产标准规定：当发酵液解磷细菌浓度达到2×108个/ml时，发酵结束，分装入库。产品出库时需采用______________________进行活菌计数，取0．2ml发酵液涂布时应选择稀释___________倍（填“105”或“106”）。
稀释涂布平板法
新题型：稀释涂布平板法用于活菌计数，应选择长出30 ~ 300个菌落的培养基为宜，此类题型建议还是带入公式正向解。
30~300
0.2ml
× 10n = 2×108个/ml
可以求出n是6，且此时的每个平板的菌落数约为40
[2020北京] 枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。
2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为_____________________________________________________________________。
2. 新高考不再有选考内容，为了覆盖全面，青睐于把重点内容：微生物培养和基因工程一起考察
多
葡萄糖
密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸
考法3 结合环保背景和基因工程考察
3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。
4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________________________。 5）略
BamHI、SmaI
向培养基中接种纤维素酶（C1酶）
[2020浙江卷] 回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与泡菜制作有关的问题：
1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_________，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_________________________________________________________。
2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使_____________菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用_______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______________，以便观察是否产酸。
4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
3. 微生物培养和基因工程一起考察时，未必要有相同背景
果胶酶
细胞破裂，营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质
好氧
不耐酸的
稀释
涂布
酸碱指示剂
乙醇
考法3 结合环保背景和基因工程考察
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经____________处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有__________________________（答出2点即可）。
2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用_____________或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用_______________，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
3）原生质体在培养过程中，只有重新形成_________后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过_____________或器官发生的途径再生植株。
3. 微生物培养和基因工程一起考察时，未必要有相同背景
过滤灭菌
染色法，渗透吸水或失水
化学合成
两种限制酶
扩增
细胞壁
胚胎发生
考法3 结合环保背景和基因工程考察

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