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[高考揭秘]
从3年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景，将会收到良好的效果。
① PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理
② 基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景
③ 微生物的选择和鉴别是核心考点，结合基因工程改造近几年命题趋势
④ 细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察。
⑤ 热点考察：新冠检测相关技术，酵母双杂等复杂情景
(题目主要来源：2019-2022年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
第2讲：基因工程的高频考点与情景
考法1 基因工程的核心内容
考法2 限制酶的选择 （高频）
考法3 正反接的检测方式（难点）
考法4 基因编辑（反义基因、课本CRISRP/Cas9）
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
1. 基因工程中的4个“3”
—— 基因工程的3种基本工具
① 限制酶：
识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。
注意：不是只识别一种序列，有些可以识别摇摆的序列
② DNA连接酶：
E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；
T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。
③ 载体：需具备的条件包括：
a. 能在宿主细胞内稳定存在并大量复制。
b. 有一个至多个限制酶切割位点。
c. 具有标记基因，以便对目的基因进行检测。（注意条件和作用得区分）
考法1 基因工程的核心内容
1. 基因工程中的4个“3”
—— 获取目的基因的3条途径
① 从基因文库中获取：
基因组文库：包含某生物的全部基因片段
cDNA文库：不含启动子，终止子和内含子，方便进行基因工程的基因交流
② 利用PCR技术扩增；
③ 用化学方法直接人工合成：常用mRNA逆转录现成cDNA
考法1 基因工程的核心内容
1. 基因工程中的4个“3”
—— 将目的基因导入受体细胞的3种类型
①植物：
体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、
花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物，老教材)。
②动物：
受精卵——显微注射技术。
③微生物：
常用大肠杆菌——钙离子处理法（严格按课本填，不要写感受态细胞法）。
考法1 基因工程的核心内容
1. 基因工程中的4个“3”
—— 目的基因分子水平检测的3个层次
① 检测目的基因是否插入到转基因生物的DNA上：
PCR或DNA分子杂交技术（两个都答）。
② 检测目的基因是否转录出了mRNA：
PCR或分子杂交技术。
③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质：
抗原—抗体杂交技术。
如果问的是原理：
抗原和抗体可以特异性结合
考法1 基因工程的核心内容
[2020·山东省高三期末节选] 血管内皮生长因子(VEGF)是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
研究人员利用pVAX1质粒和VEGF基因构建了pVAX1—VEGF的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：
1) 首先从人的肺癌细胞株A549中提取mRNA，通过__________法获得VEGF基因。
3)构建的pVAX1—VEGF上应含有特定的________(填“复制原点”“启动子”或“标记基因”)，它能被受体细胞的______________所识别，以便于催化转录过程。
4)DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是______
_______________________________________________________________________。
反转录
启动子
RNA聚合酶
DNA疫苗注入体内后，可能整合到宿主基因组上，导致细胞发生变异，使细胞功能异常
2.(2020·河北省邯郸一中高三月考)基因工程载体是DNA重组技术使用的基本工具。回答下列问题：
1) 大肠杆菌的质粒常被用来做基因工程中的载体，其主要优点是_________
_________________________________________________________(至少两项)。基因工程中常使用的载体除质粒外，还有______________________________(至少两项)。
2) 在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造过的。在构建基因表达载体时，通过人工改造，基因表达载体中除了含有目的基因外，还必须有__________________________________等。构建目的基因表达载体的目的一方面是使目的基因在受体细胞中________，并遗传给下一代；另一方面，使目的基因能够____________________，从而得到转基因产品或生物。
能自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点
噬菌体、动植物病毒
启动子、终止子和标记基因
稳定存在
表达并发挥作用
2. 基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建
① 基因表达载体的组成：基因表达载体＝启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因＋复制原点
目的基因插入启动子下游，终止子上游
② 基本构建过程：
我们会更加倾向于选择双酶切，因为可以避免
质粒和目的基因的自生环化以及
反向连接。
考法1 基因工程的核心内容
2. 基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建
③ 启动子具有物种特异性和组织特异性
—— 例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候
药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子后面
—— 枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，在构建基因表达载体时，W基因上游启动子应选择___________（填写字母）。
A．枯草芽孢杆菌启动子 B．乳酸杆菌启动子 C．农杆菌启动子
让W基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸杆菌启动子。
B
考法1 基因工程的核心内容
[典例] 研究人员利用生物工程技术，探究猪bmp15基因在不同组织细胞中的特异性表达。该工程技术基本流程如下图(EGFP基因控制合成增强型绿色荧光蛋白；过程②表示表达载体2成功导入各组织细胞)。请回答：
1）过程①中，需利用____________________限制酶处理表达载体1。
2）过程②中，常采用_______________技术将表达载体2成功导入受体细胞。
XhoⅠ和Hind Ⅲ
显微注射
3）在实验结果的基础上，提取上述猪肌肉细胞的_______(填“mRNA”或“DNA”)，利用标记的___________作探针，进行分子杂交，可进一步探究猪bmp15基因特异性表达的原因。
4）实验结果表面，猪bmp15基因在________细胞特异性表达。
猪卵巢
mRNA
EGFP基因
1. 限制酶选择的基本方法
① 选择的限制酶的切点不能位于目的基因内部，所以上述不能选择_______
答案：SmaⅠ
② 当标记基因唯一时，也不能位于标记基因内部，否则会破坏目的基因或标记基因，上图中不能选择___________。
答案：SmaⅠ
考法2 限制酶的选择 （高频）
1. 限制酶选择的基本方法
③ 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，同时质粒上也有其切点，如上图中可选择______________。
答案：PstⅠ
④ 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如上图也可选择用_____________________两种限制酶。
答案：PstⅠ和EcoRⅠ
考法2 限制酶的选择 （高频）
[2023广东校联考] 为使目的基因与载体正确连接， 在设计 PCR 引物时可添加限制酶 ________________的识别序列。
XhoⅠ和MunⅠ
—— 考察排除法：因为使用S和N会破坏目的基因，使用E会导致重组质粒两个标记基因都被破坏
2. 同种酶和同尾酶 —— 及重点题型分析
限制酶 ① BamHI ② BglⅡ ③ HindⅢ ④ XbaI
识别序列和切割位点 G↓GATCC A↓GATCT A↓AGCTT T↓CTAGA
过程②需要的限制酶是______
质粒需要的限制酶是________
提示：双标记基因得切除一个
①③
①③
考法2 限制酶的选择 （高频）
[上一页的题目继续节选] 研究发现人溶菌酶（hLZ）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取）。过程如图所示。其中编号①~⑨表示过程;质粒S中的基因Len通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸），基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制性核酸内切酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：
2）为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞。质粒S中用作标记基因的是____________________________________________________________________。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是__________________。若用PCR检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样本DNA为模板，使用目的基因的特异性引物进行PCR扩增，同时将以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，将以___________________________________________为模板的组别作为阴性对照组。
非目的基因片段或S质粒
基因Leu、基因GFP (就算要被目的基因切除也算标记基因)
不含有亮氨酸
[2022湖北节选] 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。
3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_____________________酶切割S基因的cDNA和载体。
XbaⅠ、HindⅡ
考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）
[补充知识点] 即便我在质粒插入了目的基因，但是有时候可能根本无法表达，常见原因分析：
① 目的基因不能正常表达（转录和翻译过程受阻）；
② 目的基因反向连接
1. 利用电泳进行检测
2. 利用PCR进行检测
后续如有其他方式再补充
[2022广东高三统考节选] 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图1所示，①~④为操作步骤，限制酶BamHI、BglⅡ、EcoRI酶切位点唯一，BamHI和EcoRI之间的距离为20kb，BamHI和BglⅡ之间距离为25kb, 识别序列和切割位点如表4所示。请回答：
限制酶识别序列和切割位点
Bam HI —G' GATCC—
BglⅡ —A' GATCT—
EcoRI —G' AATTC—
1. 使用电泳进行检测
考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）
2） 目的基因用BamHI和BglⅡ剪切，质粒用BamHI剪切，剪切后的目的基因和质粒能连接在一起，原因是_________________________________________。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用 ____________________酶对两种重组质粒进行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如图2所示，图中 (填“样品1”或“样品2”)为所需基因表达载体。
切割DNA后产生相同的黏性末端
BamH I和EcoR I
样品2
限制酶识别序列和切割位点
Bam HI —G' GATCC—
BglⅡ —A' GATCT—
EcoRI —G'AATTC
难点分析：
笔记：同尾酶的酶切切位可以连接，但是连接后，不能再被这两种酶识别
4） 易错题：
步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加__________以便筛选岀含目的基因的甘蓝植株。
答案是潮霉素，
因为只有TDNA中的基因会到整合到植物当中！！！
限制酶识别序列和切割位点
Bam HI —G' GATCC—
BglⅡ —A' GATCT—
EcoRI —G'AATTC
[2019·江苏] 图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
1)EcoR Ⅴ酶切位点为 ，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为________末端。
平
2) 用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为__________
的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在____________酶作用下，形成重组质粒P3。
胸腺嘧啶(T)
DNA连接
2. 利用PCR进行检测
考法3 正反接的检测（难点，需要绘图）
3) 为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________________、_______________________________。
菌落类型 平板类型　　　　 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
B
A类菌落含有P0
C类菌落未转入质粒
4) 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________。
乙、丙
目的基因反向连接
1. 反义基因：是指一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子
2. 双链RNA：类似前者，在同个基因内部插入反序列导致mRNA形成发卡
3. CRISRP/Cas9：课本出现两处
考法4 基因组编辑（基因敲除或抑制）
1. 反义基因：注意构建的目的基因与需要抑制的基因序列相反
[2023陕西一模，结合了上一讲为目的基因添加酶切位点和本节反义基因] 维生素A在体内转化为11-顺式视黄醛后，与视网膜特定细胞中的视蛋白结合成视紫红质。视紫红质接受光信号后，11-顺式视黄醛转变为全反式视黄醛，视紫红质构象发生变化，激活细胞内的信号通路，最终产生视觉。全反式视黄醛与视蛋白脱离，经复杂的转运和酶促反应，再度转变为11-顺式视黄醛而被重复利用。最新研究表明，一种G蛋白偶联受体RGR可能参与了视觉产生的某些过程。为研究RGR的作用机理，某研究小组利用基因工程培育出含RGR反义基因（反义基因是通过原基因反向连接在载体的启动子和终止子之间，其转录出的mRNA与原基因转录出的mRNA互补配对）的转基因小鼠（rgr），研究该基因的功能。回答下列问题：
考法4 基因组编辑（基因敲除或抑制）
1) 为构建RGR反义基因重组载体，需先设计引物，通过PCR技术特异性扩增RGR反义基因。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，即在引物A的___________（填“3′端”或“5′端”）添加___________限制酶识别序列，在引物B添加___________限制酶识别序列。
2) 培养转基因小鼠过程中，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是_______________，常用的受体细胞是___________，选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分，还需要添加___________起筛选作用。
EcoRⅠ
BamHⅠ
5′端
显微注射法
受精卵
四环素
解释：利用基因工程构建RGR反义基因表达载体时，需要将目的基因RGR反向连接在基因表达载体上，因此在引物A添加BamHⅠ限制酶识别序列，在引物B添加EcoRⅠ限制酶识别序列。
3) 研究人员将正常小鼠（WT）和转基因小鼠（rgr）都平均分成两组，一组在黑暗中饲养12h，另一组在光照下饲养12h；随后测定小鼠眼睛中11-顺式视黄醛、全反式视黄醛和视紫红质的含量，结果如图所示。
据图分析，光照条件下RGR的作用机理可能是__________________。
RGR通过促进全反式视黄醛转化为11-顺式视黄醛，
进而增加视紫红质的形成
[2022年广东校联考] 杨树生长速度快、木材优质，是优良的纸浆原材料。木质素是植物体中总量仅次于纤维素的有机物，其含量影响纸浆质量。在制浆造纸工艺中，需要投入大量的化学药品脱出木质素，且产生大量污染环境的废液。采用基因工程技术调控木质素的生物合成，培育低木质素含量的植物新品种，对造纸、纺织和饲草等原料的生产具有重要意义。己知木质的合成途径中，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)具有重要作用。研究人员利用基因工程技术降低CCR的活性培育低木质素杨树新品种。回答下列问题:
1）从新鲜幼嫩叶片提取基因组DNA，获得CCR基因。获取基因后利用PCR技术进行扩增，设置扩增条件均为： 94°C预处理5min；94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 30s，共35个循环。其中94°C、55℃处理目的分别是 ___________________ 、 。
使目的基因解聚为单链(1分)
1. 反义基因：
考法4 基因组编辑（基因敲除或抑制）
使引物与模板链结合(1分)
2）CCR基因连接到pUCCRNAi质粒后,重组pUCCRNAi质粒换用其他两种_________ 酶进行酶切，使CCR基因与pUCCRNAi质粒进行反向连接，得到重组表达载体。CCR基因、重组表达载体的结构如下图所示，a~d 表示CCR基因的4个位点。CCR基因重组表达载体将CCR基因的_______ 位点连接到重组表达载体模板链3'处，则重组表达载体转录产生的mRNA可以减少CCR的合成，理由是_________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
3）重组表达载体先导入 细胞中再对杨树细胞进行转化。若从个体水平对转基因杨树进行鉴定，可检测其 。
限制(1分)
b(1分)
目的基因转录产生的mRNA与CCR基因转录产生的mRNA发生碱基互补配对，形成双链结构，从而抑制mRNA翻译产生CCR(4分)
农杆菌(1分)
CCR含量、木质素含量(2分)
[2021辽宁锦州统考一模节选] 番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化作用下转化。科学家利用基因工程设计的重组DNA（质粒三）能表达出双链RNA（发卡），番茄细胞可识别双链RNA并将该双链RNA和具有相同序列的单链RNA一起降解，从而阻止番茄红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。请回答下列问题：
2. 双链RNA：在同个基因内部插入反序列导致mRNA形成发卡
考法4 基因组编辑（基因敲除或抑制）
1）该基因工程中，“目的基因”是____________________基因，要想对该目的基因进行体外扩增，可从番茄组织中提取mRNA，通过逆转录获得____________用于PCR扩增。PCR扩增目的基因，需要设计相应的引物，设计引物时要避免引物之间出现_____________________。
碱基互补配对
番茄红素环化酶
cDNA
2）PCR扩增时，DNA先在高温下_______键断裂，双链解链，然后在温度缓慢下降的过程中，引物与解开的链结合，这个过程叫做退火。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。长度相同但__________________的引物需要设定更高的退火温度。
氢
GC含量高
3）“质粒二”利用_______________开环。为了防止其自身环化，要去除开环的质粒两端的_______个磷酸基团。
4）构建质粒三时，最好在目的基因A、B两端分别加_______________________识别序列，目的是___________________________。
5）对于培育成功的转基因番茄植株，“发卡”在细胞内可以阻止_______过程，从而使番茄红素环化酶基因“沉默”。
翻译
BamHⅠ酶
Ecl酶、BamHⅠ酶
确保目的基因反向连接
2
3. CRISRP/Cas9
CRISPR 相关基因位于细菌中。当外源 DNA 入侵细菌时，细菌将其作为新的“间隔序列”整合到自己的基因组中，从而使 CRISPR 相关基因能“记住"攻击过自己的外源基因。当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和剪切，以达到保护自身的目的。其中 crRNA为 CRISPR 相关基因的转录产物，其与 Cas 酶结合就能起到基因剪辑的作用。
[2021海南] CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________。
2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对。随后，Cas9蛋白可切割___________________________________序列。
DNA连接酶
钙离子处理法
目标DNA特定的核苷酸序列
4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是_________________________，基因敲除成功的判断依据是____________。
5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
DNA分子杂交技术
出现杂交带
以下三个空是答案，第二个和第三个长空都是错的
4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是_________________________，基因敲除成功的判断依据是____________。
5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，此时复合物根据sgDNA序列把靶位点序列切除，然后将新基因序列同源重组到缺口位置（或者简单回答为利用新基因自我修复）
DNA分子杂交技术
从受体细胞中提取的基因组DNA与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功
以下为修改答案（蓝色字体）

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