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(共28张PPT)
[高考揭秘]
从3年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景，将会收到良好的效果。
① PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理
② 基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景
③ 微生物的选择和鉴别是核心考点，结合基因工程改造近几年命题趋势
④ 细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察。
⑤ 热点考察：新冠检测相关技术，酵母双杂等复杂情景
(题目主要来源：2019-2022年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
第1讲：PCR的原理和多项复杂情景
考法1 PCR的原理和操作
考法2 引物的设计（添加酶切位点等）
考法3 定点诱变（新教材，近期考察热点）
补充：退火温度的考量
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
启示：寻找目的菌种时要
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
1. PCR的原理
① 概念：PCR全称为 ，是一项在生物 （体内/体外）复制特定DNA片段核酸合成技术
② 原理：______ 。
聚合酶链式反应
体外
DNA双链复制
考法1 PCR的原理和操作
备注：如果有两个空，可以回答“DNA分子的热变性原理”
条件 参与组分 在DNA复制中的作用
体内 PCR 模板 DNA的两条母链 提供DNA复制的模板
酶 解旋酶 打开DNA双链
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
场所 细胞内液（核液） 为DNA的合成提供场所、维持pH等
微量的含目的基因的DNA
90℃以上高温
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
缓冲液，一定要加Mg2+哦！
2. PCR技术的条件
考法1 PCR的原理和操作
条件 参与组分 在DNA复制中的作用
体内 PCR 原料 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
4种脱氧核苷酸
实际操作时，加入的是四种脱氧核苷三磷酸（dNTP），既为反应提供原料，又提供了能量。
脱氧腺苷三磷酸（dATP）
腺嘌呤脱氧腺苷酸dAMP
断裂两个高能磷酸键
2. PCR技术的条件
考法1 PCR的原理和操作
3. 引物
① 前提：要有一段 ，
以便根据这一序列合成 。
② 引物的化学本质：是一小段 ；
已知目的基因的核苷酸序列 (绿色为目的基因)
引物 (黄色为引物)
DNA (体内复制引物是RNA）
考法1 PCR的原理和操作
③ 延伸时需要加入两种引物，原因是
_____________________________________________________________________________
。
3. 引物
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，
用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
考法1 PCR的原理和操作
4. PCR反应的基本步骤
① 变性：90℃以上，双链DNA解旋。
② 复性：退火到55℃，引物与单链DNA结合。
③ 延伸：72℃，
脱氧核苷酸在Taq 酶
的作用下合成新的DNA子链
考法1 PCR的原理和操作
4. PCR反应的基本步骤 —— （视频）
5. 重点问题：PCR的目的是扩增目的基因？还是目的基因所处整个DNA？
DNA聚合酶能特异性地复制_________的DNA序列。
答案：处于两个引物之间的 ！！！（引物及其内部序列成指数型增长）
—— 第几次循环得到单纯的目的基因？
考法1 PCR的原理和操作
[2019年新课标I卷] 基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括____________________和______________________。
基因组文库
部分基因文库
[2019年新课标I卷] 基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_____________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_____________。
3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的原因是
____________________________________________________________________。
加热至90℃以上
氢键
Taq酶是热稳定DNA聚合酶，在PCR高温环境下，保持活性；
而大肠杆菌的DNA聚合酶不具有热稳定性，在PCR高温环境下，易失活
DNA解旋酶
6. 旁栏思考题：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，到目前为止耐高温RNA聚合酶还没有发现
①逆转录酶以RNA为模板合成与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，
形成双链DNA分子，即cDNA
以后答题直接简化为 RNA 逆转录形成 cDNA !!!!
逆转录
Reverse-Transcription
RT-PCR
考法1 PCR的原理和操作
1. 引物的基本要求：
引物自身不能环化
两种引物之间不能互补配对
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
2. ③ 两种引物与模板链如何配对？
引物的5′端与模板链3′端互补配对
考法2 引物的设计（为目的基因添加酶切位点等）
[典例] 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
1）第1组：_______________________ ；
2）第2组： _________________________ 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
考法2 引物的设计
[典例] 如图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向．
[典例] 若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是_______ 。
引物甲、引物丙
[2022烟台统考二模] 三氯生是一种抑菌物质，具有优异的贮存稳定性，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。已知fabV（从霍乱弧菌中发现的烯脂酰ACP还原酶）基因可以使大肠杆菌抵抗三氯生。
1)通过PCR方法获取fabV基因时，Taq酶只能从__________________延伸DNA链，而不能从头开始合成DNA，因此需要先根据_____________________________________设计两种特异性引物序列。反应体系的初始温度设置在90～95℃的目的是____________________。
引物的3′端
目的基因fabV基因两端碱基序列
使fabV基因受热变性后解为单链
2)在④步骤中，科研者需将大肠杆菌菌液利用稀释涂布平板法接种到加有三氯生的细菌培养基上，待菌落长成后，直接挑取菌落加入到PCR反应系统中进行基因鉴定。PCR过程中不需要先提取细菌DNA的原因是________________________________________________________________________________________。
3) 某科研团队将可以受温度调控的基因插入上述选出的重组质粒中，构建了温度调控表达质粒（如图2）。其中C基因在低温下会抑制P1，R基因在高温下会抑制P2。如果将lacZ基因和GFP基因插入图2质粒中，使得最后表现为低温下只表达GFP蛋白，而高温下只表达lacZ蛋白。则lacZ基因插在_____________之间，GFP基因插在______________________之间。
P2→T2
大肠杆菌属于原核生物，其DNA是裸露的，可以直接作为PCR模板，且PCR变性阶段的高温可直接杀死细菌，使其释放DNA （本段需要做笔记储备）
P1→T1
结论：
① n次复制后含有引物A的_______个。
含有引物B的_______个。含有引物A和B的_______个。
②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。
3
2n-1
2n-1
2n-2
3. PCR反应的数量关系
[2023咸阳模拟节选] 大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根的侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下。
1)过程①PCR扩增sGFP的原理是_____________________，该过程除需要根据___________________________设计特异性引物序列外，为保证sGFP正确插入到质粒中，还需要在目的基因两端添加图中_________________限制酶的识别序列。
4. PCR为目的基因提供酶切位点
DNA的半保留复制
(2)过程②需要的工具酶是___________。研究中将sGFP插入启动子和终止子之间的目的是___________。
(3)过程③中需要配制细菌培养基，配制时要在培养基灭菌并冷却到80℃左右后，再加入潮霉素溶液，潮霉素不能与培养基一同灭菌的原因是___________。
(4)选择过程③筛选培养得到的不同农杆菌菌落，分别提取细菌质粒DNA，并用BamHI和HindⅢ完全酶切，可以得到___________种长度不同的DNA片段。
(5)将导入重组质粒的农杆菌加入大丽轮枝菌的孢子细胞悬液中，在适宜条件下完成转染后利用滤膜过滤得到孢子细胞，再在真菌培养基上培养获得菌落，最终通过检测___________，筛选出绿色荧光蛋白旺盛表达的大丽轮枝菌。
【答案】(1) sGFP两端（3'端）核苷酸序列##sGFP两端（3'端）碱基序列
(2) DNA连接酶 保证sCFP能在大丽轮枝菌细胞中表达
(3)潮霉素在灭菌时结构被破坏，无法筛选出转化成功的受体细胞（意近即可）
(4)三
(5)大丽轮枝菌菌丝细胞中绿色荧光强度
sGFP两端3'端碱基序列
HindⅢ和BamHI
考法2 引物的设计
[典例] 用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（ ）
D
4. PCR为目的基因提供酶切位点—— 如何构建（难点）
考法2 引物的设计
[难题：2023校联考] 1965 年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰 岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图 1 所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学 家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB 法是根据胰岛素 A、B 两条肽链的氨基酸序列 人工合成两种 DNA 片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA 法是利用胰岛B 细胞中的 mRNA 得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉 C 肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图
分析并回答下列问题：
1) 由于密码子具有___________ ，AB 法中人工合成的两种 DNA 片段均有多种可能的序列。 ____________________(填“AB”、 “BCA”或“AB 和 BCA”) 法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
2) 图 2 是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
简并性（1分）
AB和BCA（2分）
2) 为使目的基因与载体正确连接， 在设计 PCR 引物时可添加限制酶 ___________________________的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过 PCR 技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是 5’ 3’。
XhoⅠ和MunⅠ（2分）
-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-（2分）无补充答案，其他答案均为0分
3) β-半乳糖苷酶可以分解无色的 X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经 (处理方法) 的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X－gal 的培养基 上筛选出 色的菌落即为工程菌种。
4) 科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获 得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→ →推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱 氧核苷酸序列。
钙离子处理（2分）
白（2分）
设计预期的蛋白质结构（1分）
评分标准 典型错误 备注
简并性（1分） AB和BCA（2分） （2）第一空，XhoⅠ和MunⅠ （2分），2种限制酶，答对一个给1分，错答不扣分， 第二空， -CTCGAGCCTTTCAGCTCA-（2分），无补充答案，其他答案均为0分（3）钙离子处理（2分） 白（2分） （4）设计预期的蛋白质结构（1分） （1）第一空：特异性，随机性，摇摆性，兼并性，碱并性，专一性，特殊性，通用性。第二空：AB、BCA。 （2）XhoⅠ或MunⅠ，-CCTTTCAGCTCA-，-GGAAAGTCGAGT- （3）第一空：钙离子、钙离子培养液（1分）、感受态法（1分）、高钙—高pH法（0分）、农杆菌转化法（0分）第二空：无色（0分）蓝色（0分）（4）设计预期的肽链/氨基酸结构（0分）推测相应的核苷酸序列（0分）推断氨基酸的种类（0分） （1）第一空：多数学生忘记了这个知识点，或者有记忆但不牢固，错别字多；第二空：大部分学生答不到正确答案，没有正确理解题意。 （2）第一空多数学生没有从两种限制酶角度考虑，多数只答出一种限制酶，第二空只有极少数同学答正确。 （3）第一空：多数同学能写出钙离子，但是题干要求填的是方法；不少同学与高钙—高pH法弄混；少部分同学写了感受态转化法，本次与教材严格保持一致，所以只给了1分第二空：部分同学写蓝色；还有不少同学写无色，不得分（4）采分点在蛋白质的结构，
—— 与目的基因处添加酶切位点一样，PCR利用设计的独特引物也可以使基因的碱基发生替换 ！
[2021北京十一中校考] 萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。
1) 研究者用相同的__________________________酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到重组质粒，再将重组质粒置于经________处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌。
2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。
① 这是利用PCR技术实现了定点的________。
基因突变
限制酶和DNA连接
Ca2+

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