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(共20张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第3课时
DNA片段的扩增及电泳鉴定
第3章　基因工程
SW-PWF
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
探究·实践
一、实验原理
(1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的 ，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
(2)PCR扩增DNA片段还利用了
的原理。一次PCR一般要经历 次循环。
DNA的热变性
温度
解聚与结合
DNA半保留复制
30
5’-
-3’
3’-
-5’
3’-
-5’
5’-
-3’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
3’-
-3’
高温
变性
延伸
复性
低温
中温
1次循环
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
(1)带电粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，这些基团可以带上____________。
(2)迁移动力与方向：在____的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是_____。
(3)迁移速度：PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________、_____________和____等有关。
(4)检测：凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的_______下被检测出来。
可解离的基团
正电荷或负电荷
电泳
相反
电场
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
探究·实践
一、实验原理
（呈负相关）
琼脂糖凝胶电泳
(1)凝胶浓度：制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。
影响DNA迁移速率的因素
(2)DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。因此，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大， 离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。
(3)DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
1.用具:
(1)PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增)
(2)微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所)
(3)微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体)
(4)一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头)
(5)电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)
PCR仪
微量移液枪
电泳装置
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
PCR反应体系的配方
为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(2)电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝)、琼脂糖和核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等。具体内容见P117。
EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略地估计样品中DNA含量。（EB有剧毒）
电源
+
电泳槽
琼脂糖凝胶
样品孔
缓冲液
—
DNA分子可发生两性解离，其等电点为pH2-2.5，当电泳缓冲液pH大于其等电点时，DNA分子带负电，当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5)，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
1.DNA片段的扩增过程
移液
用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在 ＿ 中依次加入各组分。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约 ，使反应液集中在离心管的 （提高反应速率）。
反应
参照下表的参数，设置好 的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
微量移液器
微量离心管
10s
底部
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
PCR仪
微量移液器使用方法
容量设定
吸液枪头安装
预洗吸液枪头
吸液
放液
卸去吸液枪头
应采取旋转安装法，用力不能过猛。
先向下按压推动杆至第一停点，然后将吸液枪头垂直侵入液面，再平稳松开。
将吸液枪头紧贴容器壁，先向下按压推动杆至第一停点，稍作停顿后再按至第二停点，确保吸液枪头内没有液体残留。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
2.PCR扩增产物电泳鉴定的过程
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
电泳仪
电泳槽
制好的
琼脂糖凝胶
制胶模具
梳子
梳子
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
四、注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
五、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
五、结果分析与评价
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
未出现扩增条带可能的原因有：
①TaqDNA聚合酶失活；
②引物出现质量问题；
③变性时温度低，变性时间短
④Mg2+浓度过低
出现非特异性扩增带可能的原因有：
①引物特异性不强或容易聚合成二聚体
②复性时的温度过低
③DNA聚合酶的浓度过高
④模板DNA出现污染
⑤Mg2+浓度过高
对照组设置
项目 无关DNA 模板DNA 目的DNA 引物
阳性对照1 + — + +
阳性对照2 — — + +
阴性对照1 — — — —
阴性对照2 + — — +
无关DNA：不包含目的序列，它和模板DNA在长度、浓度等方面均相近。
模板DNA：用于PCR扩增的DNA
目的DNA：已知的包含目的序列的片段，可以是重组DNA、基因组DNA等，目的DNA的浓度应与模板DNA的浓度相近。
阳性对照：用于检测PCR扩增效率
阴性对照：用于检测是否存在含有目的序列的DNA的污染。
凝胶载样缓冲液
溴酚蓝和二甲苯青FF是两种在电场中以预知速率向正极泳动的染料。溴酚蓝呈现蓝紫色，与长300bp的双链线状DNA的迁移速度相同，而二甲苯青FF呈现蓝色，与长4kb的双链线状DNA的迁移速度相同。这两种指示剂能够分别显示300bpDNA和4kbDNA的电泳进程，指示终止电泳的时间。在电泳时，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，要停止电泳。染料的另一个作用是使样本呈现颜色，完成加样的加样孔呈现 蓝色，未加样的加样孔为无色，从而使加样操作更加便利。
样品密度较小，容易流人附近加样孔，会造成交叉污染，影响结果的分析。缓冲液中含有的甘油或蔗糖成分能够增加样品密度，保证每个样品更 容易沉入各自的加样孔，防止飘散进人其他加样孔。
DNA标记 （DNAMarker），
凝胶电泳时用到的标准参照物是DNA标记 （DNAMarker），它含有若干组碱基对数目已知且具有一定梯度变化的DNA片段。DNAMarker和 样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。
探究 实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果
谢 谢 观 看

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