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第2节 基因工程的基本操作程序
第2课时
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
第3章　基因工程
SW-PWF
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
第三步、将目的基因导入受体细胞
基因表达载体
受体细胞
导入
动物
植物
微生物
将目的基因导入不同受体细胞的方法有何不同？
(一)将目的基因导入植物细胞
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
(2)操作方法：
方法1：花粉管通道法
(1)实例:
我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。培育出了“转基因抗虫棉”
A.子房注射：
花粉管通道法导入外源DNA
在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
B.花柱滴加：
花粉落到柱头上刺激花粉管萌发并生长至子房
滴管蘸取外源DNA溶液涂抹雌蕊柱头
外源DNA沿花粉管通道进入胚囊
外源DNA
进入受精卵
DNA随机整合
(一)将目的基因导入植物细胞
萌发的花粉管
花柱
子房
胚囊
卵细胞
柱头
利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
(3)原理：
(一)将目的基因导入植物细胞
(4)优点：
a.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染______植物和____植物，对大多数＿＿＿植物没有侵染能力。
(1)转化：
方法2：农杆菌转化法
是指目的基因 受体细胞内，并在受体细胞内＿＿＿＿＿＿的过程。
进入
稳定维持和表达
(2)农杆菌的特点：
双子叶
裸子
单子叶
(一)将目的基因导入植物细胞
实质是基因重组
(2)农杆菌的特点：
b.农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 （可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA
(一)将目的基因导入植物细胞
Ti质粒
T-DNA
农杆菌
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞
(3)过程：
插入Ti质粒的 中，形成 。
导入 ,
目的基因插入植物细胞的 上
目的基因在植物细胞中
。
转入 ,
组织培养技术
(一)将目的基因导入植物细胞
目的基因
T-DNA
重组Ti质粒
农杆菌
植物细胞
染色体DNA
维持稳定和表达
两次拼接、两次导入
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
导入植物细胞
表现出新性状的植物
将目的基因插入染色体DNA中
农杆菌转化法
(一)将目的基因导入植物细胞
①两次拼接
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
(一)将目的基因导入植物细胞
②两次导入
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
(5)具体转化方法：
(一)将目的基因导入植物细胞
受精卵或体细胞
(4)受体细胞：
研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？
转两个T基因
普通棉花细胞
甲
乙
丙
思考·讨论
有三种情况，如右图所示。
若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？
甲自交→全为抗虫
乙自交→抗虫：不抗虫=3:1
丙自交→抗虫：不抗虫=15:1
方法1：显微注射法
(二)将目的基因导入动物细胞
(2)操作程序：
(1)受体细胞：
构建基因表达载体并提纯
动物的受精卵中
显微注射
早期胚胎
获得具有新性状的动物
胚胎移植
受精卵
雌性动物输卵管或子宫
①个体大，易操作。
②受精卵全能性高，易培养成完整个体。
显微注射技术
受精卵
注射器
固定吸管
显微注射仪
方法2：病毒介导法:
(二)将目的基因导入动物细胞
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
在基因工程操作中，常用 作为受体细胞，其中以
最广泛。
(1)目的:
(2)受体细胞：
(三)将目的基因导入微生物细胞
方法1：Ca2+处理:
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
大肠杆菌细胞
原核生物
大肠杆菌
繁殖快，单细胞，遗传物质较少、易培养。
(3)原核细胞作为受体细胞的优点：
(4)过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
重组表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
(三)将目的基因导入微生物细胞
(5)实例：
（胰岛素是分泌蛋白，原核生物没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
(三)将目的基因导入微生物细胞
用原核生物生产胰岛素
大肠杆菌
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
mRNA
胰岛素原
胰岛素
加工
大肠杆菌合成的胰岛素有没有生物活性
没有
【小结】目的基因导入受体细胞方法比较
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
花粉管通道法
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
如何判断？
基因表达的过程
第四步、目的基因的检测与鉴定
1.目的：
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
(1)分子水平的检测：
(2)个体生物学水平鉴定：
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体DNA 上是否插入了目的基因
2.内容：
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法:
通过PCR扩增技术或DNA分子杂交技术
A.PCR扩增技术
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
用与目的基因相关的
引物进行PCR扩增
是否扩增出目的基因
电泳操作
DNA半保留复制
原理：
a.首先取出转基因生物的基因组DNA；
b.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针；
c.使探针和转基因生物的基因组DNA杂交，若显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中。
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
B.DNA分子杂交技术
是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
基因探针
碱基互补配对
原理：
变性
变性
转基因生
物的DNA
15N
15N
基因探针
DNA分子杂交流程图
②检测目的基因是否转录出了mRNA
方法:
A.PCR扩增技术
通过PCR扩增技术或分子杂交技术
转基因生物
提取mRNA
mRNA作为模板
用与目的基因相关的
引物进行PCR扩增
是否扩增出目的基因
电泳操作
cDNA作为模板
逆转录
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
B.分子杂交技术
RNA分子杂交流程图
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
抗原抗体的特异性结合
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
(1)方法:
(2)原理:
(3)过程:
提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
转Bt基因
非转基因
2.个体生物学水平的鉴定
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
(1)抗性鉴定：
对转基因生物进行抗虫、抗病接种实验，检测是否具有抗性以及抗性强度等。
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
(2)功能活性比较：
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
2.个体生物学水平的鉴定
类型 步骤 检测与鉴定内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
第二步 目的基因是否转录出mRNA
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质
个体水平 鉴定 是否具有抗性以及抗性程度
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同
目的基因的检测与鉴定方法小结
四步缺一不可！
PCR扩增
DNA分子杂交技术
PCR扩增
分子杂交技术
抗原-抗体杂交技术
比较基因工程产品与天然产品的功能活性
抗虫或抗病的接种实验
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
基因工程的基本操作流程图----转基因抗虫棉
1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
2）都遵循碱基互补配对原则
3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
思考1 ： DNA为何能在不同生物间进行转移与拼接？
1）基因是控制生物性状的结构与功能单位
2）遗传信息传递都遵循中心法则
3）生物界几乎共用一套遗传密码
思考2：外源基因在受体细胞中能表达的原因？
DNA
（基因）
翻译
转录
蛋白质
（性状）
RNA
复
制
中心法则
思考讨论
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
到社会中去
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
到社会中去
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
到社会中去
到社会中去
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
核心知识小结
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
练习与应用
一、概念检测
练习与应用
二、拓展应用
3.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是__________________，标记基因是________________，质粒pSYN12424的作用是_________________________。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？
为什么？
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
不能
若目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，则可能被切断。
练习与应用
2023/4/7
2.（1）crtⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
（2）不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
（3）维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，便其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
拓展应用
谢 谢 观 看

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