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第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时
目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
第3章　基因工程
SW-PWF
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
从社会中来
苏云金杆菌
与载体拼接
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
1.目的基因
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于 或
等的基因。
(3)实例：
与 等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要指的是 。
第一步：目的基因的筛选和获取
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
(2)作用：
编码蛋白质的基因
生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因
2. 筛选合适的目的基因
第一步：目的基因的筛选和获取
从相关的 中筛选。
(1)筛选方法：
已知结构和功能清晰的基因
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；
科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-----Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。
因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。
(2)实例：
Bt抗虫蛋白会对人畜产生影响吗？
第一步：目的基因的筛选和获取
(3)随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
越来越多基因的功能和结构被分析
DNA测序仪
核苷酸或氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
第一步：目的基因的筛选和获取
3. 目的基因的获取方法
(1)人工合成目的基因
(2)常用PCR特异性的快速扩增目的基因
(3)通过构建基因文库来获取目的基因
PCR是 的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对 的技术。
利用PCR获取和扩增目的基因
1.PCR的概念：
中文全称
原理
操作环境
目的
PCR扩增仪
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
目的基因的核苷酸序列进行大量复制
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
离心管
解旋酶
DNA聚合酶
母链(模板链)
子链(新合成的链)
四种脱氧核苷酸
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
回顾：体内DNA复制
(2)条件:
4种游离的脱氧核苷酸
DNA的两条链
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
ATP
(3)复制原则:
碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）
能量：
模板：
原料：
酶：
半保留复制、边解旋边复制
(1)特点:
DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基（-OH）的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’端到3’端延伸。
注意：
5’
3’
5’
3’
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（通常为小的单链RNA）
PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
利用PCR获取和扩增目的基因
2.DNA体外复制（PCR）的条件：
体内DNA复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
无需解旋酶，用高温(90℃以上)代替
DNA模板(含目的基因的DNA 片段)
4种脱氧核苷酸(dNTP)
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（变性）
提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
2种引物(常为小的单链DNA，通常为20-30个核苷酸)
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度超过_____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
(1)变性：
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是固定的温度？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
变性 复性 延伸
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
思考：引物结合在模板链的什么位置？
引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
(2)复性：
50℃
两
由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物
变性 复性 延伸
当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_____
__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
思考：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
Taq酶结合在引物的3’端
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
(3)延伸：
(Taq酶)
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
Taq酶
3’
Taq酶
3’
变性 复性 延伸
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
1个DNA片段
第一轮结束
形成2个不同的DNA片段
本次消耗2个引物，
1个引物1,1个引物2
①
②
第二轮结束
形成4个不同的DNA片段
本次消耗4个引物，2个引物1,2个引物2，2次循环共消耗6个引物
①
②
③
④
①
③
③
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
⑤
④
⑤
②
④
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
利用PCR获取和扩增目的基因
4.PCR的结果：
如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
(1)1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段。经过 次
循环后，刚好得到所需的目的基因;
(2)若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为
个。　　　　
N 2n
3
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8
含引物的DNA分子数 2 4 8
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6
2n
2n
2n－1
2n－2
2n－1
2n－2n
利用PCR获取和扩增目的基因
5.PCR产物的鉴定：
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用＿＿＿＿＿＿来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
PCR技术 DNA复制
相同点 原则
原料
条件
不同点 解旋方式
场所
酶
结果
PCR与DNA复制过程比较
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
DNA在高温下变性解旋
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
1.概念：
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
2.作用：
引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
3.结合部位：
引物结合在模板链的_________。
3’端
4.PCR扩增时至少需要___种引物，原因是___________________________________________________________________
2
DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增
引物的相关知识
5.PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物
6.设计引物的要求：
引物的相关知识
导致引物不能与模板链结合
(1)引物具有特异性：引物与模板DNA要碱基互补
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，使引物本身复性。
两引物之间也不应具有互补性，防止引物二聚体的形成，尤其应避免3’端的互补重叠。
(2)引物自身以及两种引物之间不应存在互补序列：
(3)引物长度一般在15-30碱基之间：
引物过短容易错配；过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq酶进行反应.
GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
(4)引物GC含量在40%～60%之间：
用PCR可以扩增mRNA吗？
问题思考
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
构建基因文库来获取目的基因
1.基因文库概念：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
2.基因文库类型：
基因组文库：含有一种生物的全部基因。
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
基因组文库与部分基因文库的关系？
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
(1)基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
基因表达载体
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
(2)部分基因文库（如cDNA文库）构建
提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
基因表达载体
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
mRNA
逆转录酶
核酸酶H
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌中储存
补充知识：基因结构-----
原核生物基因
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
①功能：不编码蛋白质，调控遗传信息的表达。
编码蛋白质。
编码区：
非编码区：
②组成：编码区上游与编码区下游。上游有启动子，下游有终止子。
编码区
非编码区
非编码区
基因
RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录
终止转录
补充知识：基因结构-----
原核生物基因
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
A G G T C A C G T C G A T C G
T C C A G T G C A G C T A G C
RNA聚合酶
A G G U C A C G U C G A U C G
转录
mRNA
翻译
cDNA文库的构建
多 肽 链
补充知识：基因结构-----
真核生物基因
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
编码区：
非编码区：
外显子：
内含子：
能编码蛋白质的序列
不能编码蛋白质的序列
基因中的非编码序列：
包括非编码区和内含子
基因
不编码蛋白质,能调控遗传信息表达
补充知识：基因结构-----
真核生物基因
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
RNA聚合酶
转录
mRNA前体
加工（剪切、拼接）
成熟mRNA
翻译
多 肽 链
cDNA文库的构建
真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA前体，
需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。
补充知识：基因结构-----
真核生物基因
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
编码区
非编码区
非编码区
转录
mRNA前体
加工（剪切、拼接）
成熟mRNA
DNA聚合酶
逆转录酶
逆转录
复制
单链DNA
cDNA
不含非编码序列。
即不含非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_______的 编码区是间隔的、________的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
区分下列概念：
非编码区、编码区、非编码序列、编码序列、外显子、内含子　
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
基因组文库和部分基因文库的比较
人工合成目的基因
1.化学方法人工合成：
(1)需要仪器：DNA合成仪。
(2)适用目的基因类型：基因比较小，核苷酸序列又已知。
(3)不需要模板。
DNA合成仪
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
推测
推测
化学合成
比如：引物
2.反转录法：
基因的相对分子质量大而又不知其序列。
目的基因的mRNA
杂交双链
(RNA-DNA)
单链DNA
双链DNA
(目的基因)
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
获得目的基因后直接转入受体吗？
问题思考
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
第二步：基因表达载体的构建
使目的基因在受体细胞中 ，并且可以 ；
使目的基因能够 。
1. 目的：
稳定存在
遗传给下一代
表达和发挥作用
2. 组成：
------是基因工程的核心工作。
包括 、 、 、 、 。
启动子
终止子
标记基因
目的基因
复制原点
位置：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游。
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。
位置：位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片断。
功能：终止mRNA的转录
作用：便于重组DNA分子的筛选。
类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
作用：基因表达载体自我复制起始的一段序列。
限制酶切割位点插到启动子与终止子之间的部位。
人工构建诱导型启动子,可激活或抑制目的基因的表达。
区分“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
启动子/终止子 起始密码子/终止密码子
位置
作用
位于DNA分子中
位于mRNA分子中
起始/终止转录
起始/终止翻译
第二步：基因表达载体的构建
3. 基因表达载体构建过程：
------是基因工程的核心工作。
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
使用两种不同的限制酶：①防止目的基因和载体的自身环化
②防止目的基因与载体的反向连接
问题探讨
双酶切
应用标记基因对重组DNA进行筛选。
3.限制酶的选择原则？
问题探讨
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
谢 谢 观 看
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti
质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌

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