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第3章 第2节
基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞
(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
思考：
为什么不能直接将目的基因导入受体细胞，而要用载体？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
基因表达载体是由哪些部分组成的呢？
Bt抗虫蛋白基因简称Bt基因
1.构建原因
① ;
② 。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
2.基因表达载体的组成
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因表达载体
（1）启动子：
一段有特殊序列结构的______片段
DNA
①本质：
②位置：
位于基因的______，紧挨_______________。
上游
转录的起始位点
③功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。
（启动子≠起始密码子）
第二步
基因表达载体的构建
终止子
启动子
目的基因
标记基因
复制原点
基因表达载体
（2）终止子：
①本质：
一段有特殊序列结构的______片段
DNA
②位置：
位于基因的_____
下游
③功能：
使转录在所需要的地方停下来
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选
（4）目的基因：
②常见类型：
四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等
如Bt基因，能控制生物表达出所需要的特殊性状
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
（终止子≠终止密码子）
第二步
基因表达载体的构建
重组DNA分子
限制酶
3.基因表达载体的构建过程
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
DNA连接酶
基因表达载体构建模式图
限制酶
启动子
限制酶切割位点
终止子
标记基因
复制原点
质粒
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
第二步
基因表达载体的构建
双酶切割：防止目的基因和质粒的自身环化和随意连接
【典例】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 )
B
A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.图示过程是基因工程的核心步骤
D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
【变式训练】以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(　　 )
A.基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B.基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
C.基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D.基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
D
（一）导入植物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
(最多)
导入方法
1.花粉管通道法：
我国科学家独创
①可以用___________将_____________________直接注入____中。
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将_________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____。
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受体细胞：
体细胞或受精卵
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
第三步
将目的基因导入受体细胞
指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
2.农杆菌转化法
①转化：
②农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力。
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b.农杆菌细胞内含有_______，当它侵染植物细胞后，能将________上的______（_____________）转移到被侵染的细胞，并且将其____________________________。
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
③利用农杆菌进行转化的思路：
将目的基因插入_______________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因_____________。
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
④农杆菌转化法的过程：
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
第三步
将目的基因导入受体细胞
⑤转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片__________________，然后________________，并______________。
受体细胞为__________
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将________直接浸没在___________________中一段时间，然后培养植株并获得________，再进行_______、________等。
受体细胞为__________
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
第三步
将目的基因导入受体细胞
——显微注射法
1.受体细胞：
受精卵
（因为受精卵容易表现出全能性）
2.过程：
构建基因表达载体
利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（二）导入动物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
——Ca2+处理法
1.受体细胞：
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最广泛。
2.原核生物的优点:
繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
3.一般过程:
用Ca2+处理大肠杆菌细胞
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）
（感受态细胞）
（三）导入微生物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
感受态细胞
吸收
Ca2+
生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法 农杆菌转化法 花粉管通道法 显微 注射法 Ca2＋处理法
(感受态细胞法)
受体 细胞 体细胞或 受精卵 受精卵 原核细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
(1)花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。( )
(2)农杆菌侵入植物细胞后，其Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。( )
(3)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。( )
(4)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。( )
×
√
√
√
【基础过关】
【典例】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(　　 )
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉
B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是
显微注射法
D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
D
培育转基因抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞
(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
Bt抗虫蛋白基因简称Bt基因
思考：将目的基因成功导入受体细胞后，为什么还要进行目的基因的检测与鉴定？
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
第四步
目的基因的检测与鉴定
表现出性状
分子水平的检测
个体水平的鉴定
mRNA
转录
蛋白质
翻译
1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
（1）方法：
DNA分子杂交
（一）检测——分子水平
基因探针：简称探针，是一段带有检测标记（放射性同位素），且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
第四步
目的基因的检测与鉴定
出现杂交带
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，
表明目的基因转录出了mRNA。
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交
第四步
目的基因的检测与鉴定
Bt抗虫蛋白
抗体
出现杂交带
蛋白质
提取
个体水平鉴定
（二）鉴定——
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
第四步
目的基因的检测与鉴定
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
病原体接种实验等
第四步
目的基因的检测与鉴定
(1)常使用PCR等技术，从分子水平上检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否转录出mRNA。( )
(2)从分子水平上检测目的基因是否翻译出相关蛋白质的方法之一是利用抗原—抗体杂交技术。( )
(3)可以通过盐碱地栽培试验从细胞水平上检测转基因抗盐碱作物是否具有抗盐碱的特性以及抗盐碱的程度。( )
√
√
×
【基础过关】
【典例】目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是(　 　)
A.检测受体细胞是否有目的基因
B.检测受体细胞是否有致病基因
C.检测目的基因是否转录mRNA
D.检测目的基因是否翻译蛋白质
D
【变式训练】PCR在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR的应用范畴的是(　 　)
A.扩增和筛选目的基因
B.检测目的基因是否导入受体细胞
C.检测目的基因是否转录出mRNA
D.检测目的基因是否翻译出蛋白质
D

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