资源简介

(共50张PPT)
重组DNA技术的基本工具
Basic tools for the recombinant DNA technology
基因工程
基因工程发展历程
History of genetic engineering
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
基因工程
指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的
和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
转基因
新的生物类型
分子水平
重组DNA技术
什么是基因工程？
别名
操作环境
操作对象
操作水平
结 果
原 理
优 点
重组DNA技术、转基因技术
生物体外
基因
符合人类需要的新的生物类型和生物产品
对基因工程概念的理解
基因重组
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
DNA分子水平
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.生物界几乎共用一套遗传密码
基因工程的诞生理论基础
【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
从社会中来
From society
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
讨论：DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
目录
01
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
02
DNA连接酶—“分子缝合针”
03
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
04
反馈练习
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
Restriction Endonuclease——"Molecular Scalpel"
01
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.简称： 。
限制酶
2.来源：
主要是从 中分离纯化出来的。
3.种类： 种。
4.特点：
识别 的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
原核生物
数千
双链DNA分子
磷酸二酯键
5.作用部位：
磷酸二酯键
特异性
限制性内切核酸酶是一类酶而不是一种酶。
11
“分子手术刀”----限制性内切核酸酶
1’
2’
3’
4’
5’
C
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
G
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
01
拓展：限制酶的名字的由来 P72
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
“分子手术刀”----限制性内切核酸酶
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
6.识别序列长度
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
6.识别序列长度
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切割形成 末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
7.作用结果:
形成黏性末端和平末端
(2)限制酶所识别的序列，呈碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
(1)限制酶具有专一性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
(3)同一种限制酶一定能切出相同的粘性末端，相同的粘性末端不一定来自用一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
回文序列
8.识别序列的特点
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？
（2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。
实践活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作
5’... G
3’... CTTAA
AATTC...3’
G...5’
AATTC ...... B t ...... G
G .....基因......CTTAA
目的基因
思考
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切开双链DNA分子。
4.根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
5.试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
旁栏思考题
请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
5’
A
T
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
两
2
2
两
学以致用
学以致用
下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，
据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（4）只用Pst Ⅰ 酶切，最多能得到 种DNA片段。
2
3
5
5
BamHⅠ ; EcoRⅠ ;
HindⅢ ; BglⅡ 。
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
判断1：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端（ ）
学以致用
判断2：相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的（ ）
√
√
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA ligase —— "Molecular suture needle"
02
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
DNA连接酶—“分子缝合针”
1、作用：
①E.coli DNA连接酶
DNA连接酶—“分子缝合针”
2、种类：
②T4 DNA连接酶
从大肠杆菌分离得到
只能连接互补黏性末端的DNA片段
从T4噬菌体分离得到
黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。
平末端
黏性末端
磷酸二酯键
DNA连接酶—“分子缝合针”
3、作用部位：
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA聚合酶
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
解旋酶
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
几种酶作用的图解
1.通过基因工程产生的变异是不定向的 （　 　）
2.限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （　 　）
3.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （　 　）
4.E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 （　 ）
5.限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ 　）
判断常考语句，澄清易混易错
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
The carrier of a gene into a receptor cell——"Molecular Transporter"
03
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
1.作用：
①携带目的基因进入受体细胞
②使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子
载体携带启动子和终止子。
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
2.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌
等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
3.常用载体：
质粒
其基因属于细胞质基因。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核与原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
终止子：转录的终点，在转录过程中起调控作用。
启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。
复制原点:DNA复制的起始位点。
标记基因
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
标记基因的作用：
标记基因通常有：
①抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
4、运载体需具备的条件：
①有一个至多个 ，供外源DNA片段（基因）插入其中。
②能够在宿主细胞中 或整合到 上，随受体DNA同步 。
③具有特殊的 ，便于重组DNA分子的 。
④对受体细胞无害、易分离，大小合适、方便操作。
限制酶切割位点
自我复制
受体DNA
复制
标记基因
筛选
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
反馈练习
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加
抗生素B，则应该选择的限制酶
为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加
抗生素A，则应该选择的限制酶
为_____。
①或②
①
1.现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，
如何操作？
39
g1
g2
g3
目的基因两端均含有特定序列，但目的基因内部不应含有相应序列。
思考分析
思考讨论——重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对
如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
思考讨论——重组DNA分子
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。
产生相同末端，便于连接。
2.目的基因是要与运载体结合的，
那如何处理质粒？
★重组质粒的形成：
用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。
思考分析
质粒的自身环化
由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。
44
3.用EcoR Ⅰ切下图含有目的基因的DNA片段，能成功不？
双酶切：用2种酶分别对目的基因和运载体切割。
…ATCGAATCATCCCGGGCATTAGTG…CCAAGTCTCTGGAATTCACGATTAG…
…TAGCTTAGTAGGGCCCGTAATCAC…GGTTCAGAGACCTTAAGTGCTAATC…
确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。
不能
…GGGCATTAGTG…CCAAGTCTCTGG…
…CCCGTAATCAC…GGTTCAGAGACCTTAA…
双酶切产生不同末端：
思考分析
习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 。但是使用该法缺点是容易发生 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是
。
产生相同的黏性末端，便于连接
目的基因与质粒反向连接
目的基因、质粒的自身环化
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
两
4
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项
反馈练习
Feedback exercises
04
1.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是
( 　)
A.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B
反馈练习
2.下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行
B
反馈练习
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