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(共82张PPT)
新课程标准 核心素养
1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。 3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 1.科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2.科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
第2节 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
从社会中来
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
从社会中来
目的基因的筛选与获取
Screening and acquisition of target genes
第一部分
DNA
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
终止子
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
编码区上游
编码区下游
真核基因
1.基因的结构
一.目的基因的筛选与获取
——原核 VS 真核基因的结构
具有遗传效应的DNA片段
（1） 非编码区
①组成：编码区上游+编码区下游
②功能：不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子）。
（2）编码区：编码蛋白质的合成
1.基因的结构
一.目的基因的筛选与获取
——原核 VS 真核基因的结构
典型的原核细胞基因的结构示意图
典型的真核细胞基因的结构示意图
原核细胞 真核细胞
不 同 点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相 同 点 都由能够编码蛋白质的_______和具有调控作用的_______区组成的
连续
不连续
编码区
非编码
（连续的）
（不连续）
基因=非编码区+编码区
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
原核细胞基因的结构示意图
真核细胞基因的结构示意图
1.基因的结构
一.目的基因的筛选与获取
——原核 VS 真核基因的结构
启动子 与 终止子
VS
起始密码子 与 终止密码子
密码子：mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基
翻译起始与终止
转录起始与终止
①定义：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因
受体细胞
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
转基因抗虫棉
目的基因 —— Bt基因
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
棉花细胞
导入
抗虫棉
培育
一.目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
基因海洋
目的基因
如何筛选
相关的已经结构
和功能清晰的基因
筛选
①筛选方法之一
一.目的基因的筛选与获取
3.筛选合适目的基因
2、目的基因的筛选
一、目的基因的筛选与获取
（1） 较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2）辅助工具
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、
序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
实例：Bt基因的筛选
一.目的基因的筛选与获取
3.筛选合适目的基因
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
③筛选目的基因的技术手段
一.目的基因的筛选与获取
3.筛选合适目的基因
方法：
3、目的基因的获取
（1）从基因文库中获取
（3）利用PCR技术扩增（常用）
（2）人工合成
一、目的基因的筛选与获取
（1）从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因组文库
部分基因文库
（包含一种生物的所有基因）
（cDNA文库）
（包含一种生物的一部分基因）
三、目的基因获取方法
1
基因文库概念
2
基因文库类型
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建
3
基因组文库的构建
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶催化
DNA聚合酶催化
部分基因文库（如cDNA文库）构建
构建
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
限制酶
与运载体连接导入
基因组文库
某种生物某个时期的mRNA
cDNA
反转录
受体菌群体
与运载体连接导入
部分基因文库（cDNA文库）
基因文库的构建过程
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
内含子、启动子、终止子
21
01
（2）人工合成
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
DNA合成仪
转基因抗虫棉
3、目的基因的获取
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成
一、目的基因的筛选与获取
PCR技术：PCR是______________ _的缩写，是一项根据___________
的原理，在___ _提供参与DNA复制的___ ____与__ _______，对___________________ _进行______ __的技术；
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
原理
操作环境
目的
优点：
复习：体内DNA复制
1.条件：
（1）DNA模板：亲代DNA分子的_____条母链
（2）原料：4种_____________
（3）酶：__________、__________
（4）能量：__________
2.原则：
____________________
(A-_____;C-______)
2
脱氧核苷酸
ATP
解旋酶
DNA聚合酶
碱基互补配对原则
T
G
①DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
（3）利用PCR获取和扩增目的基因
子链延伸
子链延伸
PCR的条件
①DNA（含目的基因）模板。
②分别与模板DNA相结合的两种引物。
③A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
④耐高温的DNA聚合酶。
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
⑥能严格控制温度的温控设备。
一小段（20-30个）能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
脱氧核苷三磷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
耐高温的Taq DNA聚合酶
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
检测方法
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。
目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
引物结合在模板链的3’端，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
为什么需要引物？因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
01
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
（3）PCR反应过程
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
目的基因的筛选与获取
PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
7.PCR产物的鉴定
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
【提醒】
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
脱氧核苷三磷酸
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。
2n
N0 2n
一.目的基因的筛选与获取
③PCR反应过程
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋
全部解旋后在复制
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3‘端合成子链
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( )
(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶( )
(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。( )
(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。( )
解析：PCR不需要解旋酶的参与。
(5)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。( )
√
×
√
×
√
【基础过关】
3.（2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：
①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；
③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指___________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
④②③①
Taq酶(耐高温的DNA聚合酶）
延伸
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
当堂巩固
基因表达载体的构建
Construction of gene expression vector
第二部分
培育转基因抗虫棉的简要过程：
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
基因表达载体是由哪些部分组成的呢？
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
二.基因表达载体的构建
——核心步骤
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
①目的基因：
②启动子：
③终止子：
④标记基因：
控制特定性状或表达特定产物。
位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。
位于基因的末端，终止转录。
检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。
⑤复制原点：DNA聚合酶结合位点。
基因表达载体的构建
基因表达载体的组成
载体≠表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
基因表达载体的构建
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
位于基因上
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
基因表达载体的构建
过程
1、单酶切（同一种酶）：
（1）目的（结果）：
产生相同的黏性末端，以便进行连接
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
①目的基因——载体连接物
②载体——载体连接物
③目的基因——目的基因连接物
②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化
拓展3：限制酶的选择
拓展3：限制酶的选择
2、双酶切
如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
使用两种限制酶的优点：①防止目的基因和载体的自身环化
②还可以防止目的基因与载体的反向连接
将目的基因导入受体细胞
Introduce the target gene into the recipient cell
第三部分
第三步：将目的基因导入受体细胞
基因表达载体
受体细胞
导入
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
动物
植物
微生物
三、将目的基因导入受体细胞
导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞
导入受体细胞的方法
受体细胞类型（常用）
①花粉管通道法
②农杆菌转化法（常用）
显微注射法
Ca2＋处理法
（又称感受态细胞法）
受精卵或体细胞
受精卵
原核细胞
感受态细胞
(能吸收周围环境DNA分子的生理状态)
（一）导入植物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
(常用)
①导入方法
1.花粉管通道法：
我国科学家独创
②受体细胞：
体细胞
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
三、将目的基因导入受体细胞
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
花粉管通道法
子房注射
花柱滴加
在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
适用生物：开花植物
花粉管通道法的过程：
三、将目的基因导入受体细胞
萌发的花粉管
花柱
子房
胚囊
卵细胞
方法1
花粉管通道法
优点
柱头
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
三、将目的基因导入受体细胞
①农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________
②利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
转化
进入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
方法2
农杆菌转化法（最常用）
Ti质粒
T-DNA
农杆菌
③农杆菌转化法的过程：
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
植物组织培养
三、将目的基因导入受体细胞
两次拼接：
第一次拼接是
第二次拼接(非人工操作)指
两次导入：
第一次导入是将
第二次导入(非人工操作)是
提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入
三、将目的基因导入受体细胞
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
④转化的具体方法：
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后_____________，并__________；
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
b.可以将____直接浸没在________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
三、将目的基因导入受体细胞
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得成功。
——显微注射法
1.受体细胞：
受精卵
(因为受精卵容易表现出全能性)
2.过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
（二）导入动物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
——Ca2+处理法
1.受体细胞：
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
2.原核生物的优点:
繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
3.一般过程:
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）
（感受态细胞）
（三）导入微生物细胞
Ca2+
感受态细胞
吸收
三、将目的基因导入受体细胞
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。
三、将目的基因导入受体细胞
种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
【小结】
三.将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
Detection and identification of target genes
第四部分
四、目的基因的检测与鉴定
①检测是否插入了目的基因（DNA）
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
分子水平
个体生物学水平
方法：DNA分子杂交、PCR技术
方法：分子杂交、PCR技术
方法：抗原-抗体杂交技术
确定是否具有特性及抗性的程度
（即个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
四、目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传
（2）基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。
可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。
1、检测是否插入了目的基因
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
四、目的基因的检测与鉴定
1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法1：PCR扩增
DNA半保留复制
原理：
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
方法2：DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
四、目的基因的检测与鉴定
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
探针与受体中的mRNA杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已转录
未转录
四、目的基因的检测与鉴定
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
原理：抗原抗体的特异性结合
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原
转基因生物
四、目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的检测
转Bt基因
非转基因
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功？
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
四.目的基因的检查与鉴定
筛选和获取目的基因
获取质粒、噬菌体等载体
构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作流程图
筛选和获取目的基因
1.利用PCR获取和扩增目的基因
2.人工合成目的基因
3.通过构建基因文库获取目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
构建基因表达载体
1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段
2.用DNA连接酶连接
第二步：基因表达载体的构建
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法
2.导入动物细胞：显微注射法
3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
1.分子水平检测
①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）
②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测）
③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）
2.个体水平检测
第四步：目的基因的检测与鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
第五部分
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；
DNA半保留复制
基因工程的基本操作程序
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关（迁移速率与之呈负相关）
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
基因工程的基本操作程序
2.材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
基因工程的基本操作程序
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
基因工程的基本操作程序
3.方法步骤
基因工程的基本操作程序
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
（1）DNA片段的扩增
3.方法步骤
基因工程的基本操作程序
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
③反应：
参照上表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
预变性：
3.方法步骤
基因工程的基本操作程序
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
3.方法步骤
基因工程的基本操作程序
③加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
（2）DNA片段的电泳鉴定
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意:
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。
基因工程的基本操作程序
3.方法步骤
4.结果分析与评价
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
基因工程的基本操作程序
【关键点拨】
1．未出现扩增条带的主要原因
2．出现非特异性扩增条带的主要原因
（1）Taq DNA聚合酶失活；
（2）引物出现质量问题；
（3）Mg2＋浓度过低；
（4）变性时的温度低，变性时间短。
（1）模板DNA出现 ；
（2）引物特异性不强或形成引物二聚体。
（3）Mg2＋浓度 。
（4）复性时的温度 等。
污染
过高
过低

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