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(共46张PPT)
第4节：蛋白质工程的原理和应用
三
级
结
构
一
级
结
构
四
级
结
构
二
级
结
构
【从社会中来】
你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画”的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为它们体内导入了荧光蛋白的基因。
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程 来实现的
知识点回顾：基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
生物体外
基因
DNA分子水平
按照人类的需要定向改造生物的遗传特性
基因重组
优点：
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
一、蛋白质工程崛起的缘由
1.缘由
基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质(天然蛋白质)
天然蛋白质不一定完全符合
人类生产和生活的需要
需要对天然蛋白进行改造产生更
符合人类需要的蛋白质
实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。
结构和功能符合特定物种生存的需要
蛋白质工程崛起
玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶：天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大。赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高。
如果我们将天冬氨酸激酶中第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。
天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要
需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质
2.实例
2.实例
＋
改造的
天冬氨酸激酶
异亮氨酸
（352位）
变为
玉米
赖氨酸
含量提高5倍
赖氨酸
天冬氨酸激酶
＋
_
_
（含量低）
二氢吡啶二羧酸合成酶
天冬酰胺
（104位）
苏氨酸
（352位）
玉米
＋
异亮氨酸
（104位）
改造二氢吡啶二羧酸合成酶
变为
玉米
赖氨酸
含量提高2倍
＋
蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以 及其与 作为
基础,通过 或 ,来改造 或
蛋白质,以满足 。
蛋白质分子的结构规律
生物功能的关系
改造
合成基因
现有蛋白质
制造一种新的
人类生产和生活的需求
基础：
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系；
操作对象：
改造或合成基因
结果：
改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质
与基因工程的关系：
目的：
以满足人类生产和生活的需求
在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
理论和技术：
分子生物学、晶体学和计算机技术
基因工程产生的蛋白质是否完全
符合人类生产和生活的需要？
1
基因工程的局限性：
a、基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质
b、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要
2
蛋白质工程的目的：
生产符合人类生产和生活需要的、并非自然界已存在的蛋白质.
天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
可以创造自然界不存在的蛋白质！
你知道人类蛋白质组计划吗 它与蛋白质工程有什么关系 我国科学家承担了什么任务
人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后,生命科学乃至自然科学领域重大的国际 合作科研项目。
2001年,国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年,该组织正式提出启动两项重大国际合作项目:一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”;另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”,由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。
对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？
答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白
质改造,主要原因如下：
①基因决定蛋白质的合成，改造基因即为改造蛋白质；
②改造基因可以遗传，改造蛋白质无法遗传；
③改造基因比改造蛋白质更容易操作。
1.蛋白质工程的目标：
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
2.改造蛋白质的方法：
改造或合成基因
3.天然蛋白质合成过程：
按照中心法则进行
基因
表达
形成具有特定氨基酸序列的多肽链
形成具有高级结构的蛋白质
行使生物功能
转录、翻译
4.基因工程的思路
基因
mRNA
转录
翻译
具有特定氨基酸序列的多肽链
具有高级结构
的蛋白质
行使生物功能
思考：蛋白质工程的思路如何？
预期的蛋白质功能
设计预期的蛋白质结构
推测应有的氨基酸序列
找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
获得所需蛋白质
预期功能
生物功能
设计
推测
改造
或合成
行使
折叠
目的基因
转录
mRNA
翻译
多肽链
蛋白质
(三维结构)
5.蛋白质工程的思路
预期功能
蛋白质
(三维结构)
多肽链
目的基因
mRNA
发黄色荧光的蛋白质
黄色荧光蛋白
黄色荧光蛋白多肽链
黄色荧光蛋白的基因
mRNA
设计
推测
改造或合成
行使
折叠
翻译
转录
5.蛋白质工程的思路
是否合成新的基因
蛋白质工程
是否对原有基因进行改造
是
否
是
否
蛋白质工程
基因工程
看蛋白质
看基因
是否为天然蛋白质
是
否
蛋白质工程
基因工程
如何区分？
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
蛋白质工程和基因工程的比较
（练习册答案23页）
思考·讨论·蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
丙氨酸
苯丙氨酸
色氨酸
谷氨酸
赖氨酸
1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列 请把相应的碱基序列写出来。提示：丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC）。
mRNA序列为：GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C）
DNA序列为：CGA（或G或T或C）ACC TTT（或C）CTT（或C）AAA（或G）
GCT（或C或A或G）TGG AAA（或G）GAA（或G）TTT（或C）
共 32 种可能序列
【思 考讨论】蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
丙氨酸
苯丙氨酸
色氨酸
谷氨酸
赖氨酸
2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
学科交叉
蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型；要制备蛋白质晶体，然后通过X射线衍射技术，分析晶体结构；要用到基因的定点突变技术来进行碱基的替换。
重叠延伸PCR
大引物PCR
补充：基因的定点突变技术1------重叠PCR技术
①该过程需要______种引物；
②PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果；
③PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果；
④产物AD的形成需要引物吗？___________________________________
⑤需要改变的碱基位于引物___和引物___上
⑥引物b和引物c之间有什么关系？__________________________________
⑦PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___
和引物___
4
a
b
c
d
b
c
引物b和引物c应有部分碱基互补的关系
a
d
不需要，但需要耐高温的DNA聚合酶
该过程需要三种引物，第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条链作为下游大引物，与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
补充：基因的定点突变技术2------大引物PCR技术
补充：基因的定点突变技术3------突变质粒
噬菌体
动植物病毒
引物
原料
耐高温
DNA聚合酶
专一性
①②③④
Ca2+
缓冲液
2023/4/10
思考P95：能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的宿主细胞中，让宿主细胞生产人类所需要的蛋白质食品呢？
理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。利用改造后的动物细胞、微生物细胞等可以生产人类需要的蛋白质，但这些蛋白质往往都是自然界中已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来的、自然界中不存在的蛋白质。
主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对大多数蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能了解得还不够，很难设计出一个全新的而又具有功能的蛋白质。
即使设计并获得了一个全新的蛋白质，它的生理生化特性、用它生产的蛋白质食品的安全性等都需要长期深入的研究。
拓展延伸
根据改造蛋白质的部位的多少，对蛋白质的改造可分为三类：
（1）大改：
设计并制造出自然界中不存在的全新蛋白质
（2）中改：
在蛋白质分子中替换某一个肽段或某一个特定的结构域。
（3）小改：
改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基
下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是__________。(填写数字)
(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容： ①______ ②______；③______；④______；⑤__________。
(3)蛋白质工程的目的是_______________________________ ___________________________，通过____________________实现。
(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是______的。
④⑤
①②③
转录
翻译
折叠
推测
改造合成
根据人们对蛋白质功能的特定需求，
基因改造或基因合成
相反
对蛋白质的结构进行分子设计
习题巩固
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
①产生速效胰岛素
②产生易保存
的干扰素
③生产人鼠嵌
合抗体
行使功能
设计结构
天然胰岛素易形成二聚体或六聚体
预期结构
改造
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
mRNA
折叠
预期功能
降低胰岛素的聚合作用
改变B链
第20～29位
氨基酸组成
推测 序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
转录
①产生速效胰岛素
②产生易保存的干扰素
天然干扰素
（体外保存困难）
改造后的干扰素
（-70℃可保存半年）
半胱氨酸
丝氨酸
干扰素在体外保存相当困难
将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸
在-70℃下干扰素可保存半年
医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低
解决办法：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。
③生产人鼠嵌合抗体
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
①产生速效胰岛素
②产生易保存的干扰素
③生产人鼠嵌合抗体
通过基因定点突变
一个氨基酸的改变或两个氨基酸位置互换
通过基因定点突变
一个氨基酸的改变
通过基因片段的拼接
两条多肽片段拼接
三、蛋白质工程的应用
2.工业方面的应用
枯草杆菌蛋白酶突变体
枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。
广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶
利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。
三、蛋白质工程的应用
3.农业方面的应用
①改造某些参与调控光合作用的酶
科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
还有科学家将蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
②改造微生物蛋白质结构，防治害虫
蛋白质工程是一项难度很大的工程。
主要原因：
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
由计算机建立的血红蛋白三维结构模型
前景展望：
科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉
三
级
结
构
一
级
结
构
四
级
结
构
二
级
结
构
习题巩固
Exercises to consolidate
1.蛋白质工程可以说是基因工程的延伸，
判断下列相关表述是否正确。
(1)基因工程需要在分子水平对基因进行操作，
蛋白质工程不需要对基因进行操作。 ( )
(2)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。( )
(3)蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。( )
×
×
√
习题巩固
Exercises to consolidate
2. 蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的
基础上进行的，它最终要达到的目的是 ( )
A.分析蛋白质的三维结构
B.研究蛋白质的氨基酸组成
C.获取编码蛋白质的基因序列信息
D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求
D
习题巩固
Exercises to consolidate
3. 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这项替换研究中，目前可行的直接操作对象是( )
A.基因 B.氨基酸 C.多肽链 D.蛋白质
A
习题巩固
Exercises to consolidate
4.T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴 在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么 如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作
习题巩固
Exercises to consolidate
这项工作属于蛋白质工程的范畴。引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如, 由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需要重新明确,包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本等。
习题巩固
Exercises to consolidate
1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)、LacZ 基因及一些酶切位点,其结构和简单的操作步骤如下图所示。
习题巩固
Exercises to consolidate
请根据以上信息回答下列问题。
（1）在第②步中,应怎样选择限制酶？
应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA 片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。
（2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？
加入DNA连接酶
习题巩固
Exercises to consolidate
（3）选用含有 AmpR 和 LacZ 基因的质粒进行实验有哪些优势？
该质粒便于进行双重筛选。标记基因 AmpR 基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于 LacZ 基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
习题巩固
Exercises to consolidate
（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？为什么？
含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
因为目的基因的插入破坏了 LacZ基因的结构，使其不能正常表达，形成 B-半乳糖苷酶，底物 X-gal也就不会被分解。
2.科学家将 Or3/4 、 Sox2、 c-Myc 和 KIf4 基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2-3周后,这些细胞显示出ES细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。
习题巩固
Exercises to consolidate
（1）在这个实验过程中，逆转录病毒的作用是什么？
逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4送入小鼠成纤维细胞。
（2）如何证明iPs细胞的产生不是由于培养基的作用？
可以设置对照组。将转入外源基因和没有转人外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。
习题巩固
Exercises to consolidate
（3）如果要了解 Or3/4 、 Sox2、 c-Myc 和 KIf4 基因在诱导iPs细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的思路。
可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可）
习题巩固
Exercises to consolidate
（4）若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPs细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应 为什么？ iPS细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可能存在什么风险？
不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。
习题巩固
Exercises to consolidate
3.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。
方案一　把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。
方案二　直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。
习题巩固
Exercises to consolidate
(1)请评估这两种方案哪种更容易实现。
从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。
(2)如果两个方案都实现的话，你认为哪种更值得推广？
请说出你的理由。
此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。

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