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第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
人教版·选择性必修3
（第二课时）
动物细胞融合技术与单克隆抗体
问题探究：
思考·讨论：
1.视频中了解到针对新冠肺炎真正的特效药是什么？
2.这种特效药有着怎样的特点呢？
针对新冠病毒的单克隆抗体。
这种单克隆抗体可以和新冠病毒特异性结合，准确定位、药效强、持续时间久，并且可以大量储备生产。
什么细胞能产生抗体？
能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？
什么细胞具有无限增殖的能力？
能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？
要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
2
3
4
5
6
回顾旧知：抗体的产生
在抗原物质的刺激下，由浆细胞（效应B细胞）产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
抗体
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
一些病原体可以和B细胞接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。
1
抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞。
3
一些病原体被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。
2
2
3
4
5
6
辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞的第二个信号；辅助性T细胞开始分裂、分化，并分泌细胞因子。
4
回顾旧知：抗体的产生
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，小部分分化为记忆B细胞。细胞因子能促进B细胞的分裂、分化过程。
5
2
3
4
5
6
浆细胞产生和分泌大量抗体，抗体可以随体液在全身循坏并与这种病原体结合。抗体与病原体的结合可以抑制病原体的增殖或对人体细胞的黏附。
6
回顾旧知：抗体的产生
病原体
抗原呈递细胞
摄取
辅助性
T细胞
处理
呈递
B细胞
分泌
细胞因子
记忆B细胞
浆细胞
分裂、分化
产生
分泌
抗体
与抗原结合
形成沉淀，进而被其他免疫细胞吞噬、消化
直接接触
信号②
信号①
二次免疫
增殖分化
病原体再次入侵，刺激
记忆B细胞
回顾旧知：抗体的产生
回顾旧知：抗体的产生
1. 传统抗体制备方法及缺陷
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗体不纯
产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。
缺陷：
如何解决这个问题呢？
抗原
免疫
传统抗血清
所有抗体混合
回顾旧知：抗体的产生
骨髓瘤细胞
能无限增殖
能产生抗体
（已免疫）B淋巴细胞
第1节学习的植物体细胞杂交技术可以打破生殖隔离，克服远缘杂交育种，培育新品种。　　　　　
有没有技术让这两种细胞进行杂交，培育出既能产生抗体，又能大量增殖的细胞呢？
一、动物细胞融合技术
1970年，科学家用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质分子，用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质分子，将小鼠细胞和人细胞融合。这两种细胞刚融合时，融合细胞的一半发绿色荧光，另一半发红色荧光。在37℃下经过40min，两种颜色的荧光均匀分布。
小鼠细胞
人细胞
细胞融合
37℃,40min
正常融合的细胞
融合细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图
一、动物细胞融合技术
1. 动物细胞融合技术
① 概念：
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性。
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法
生物法：灭活病毒诱导法
② 原理：
③ 诱导方式
④ 过程：
病毒颗粒
灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面，使细胞互相凝聚
细胞膜融合
细胞核融合
形成杂交细胞
细胞膜
打开
细胞质融合
一、动物细胞融合技术
1. 动物细胞融合技术
⑤ 结果：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。
⑥ 优点：
形成单核的杂交细胞。即融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
⑦ 应用：
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤细胞技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
一、动物细胞融合技术
2、为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？
①灭活的病毒失去感染性。
②灭活的病毒其表面的糖蛋白结构没有被破坏，能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
1、什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但并不破坏病毒的抗原结构。
病毒的糖蛋白和一些酶可以与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞膜的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
思考·讨论：
2、灭活病毒诱导细胞融合的原理是？
一、动物细胞融合技术
课堂小结
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
基本原理
融合前处理
诱导方法
用 途
意 义
细胞膜具有一定的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的的流动性
用纤维素酶、果胶酶去壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散
克服远源杂交的障碍，获得杂种植株
制备单克隆抗体
物理法：电融合法、离心法
化学法：PEG，高Ca2+ —高PH融合法
电融合法，PEG融合法，灭活病毒诱导法
植物体细胞杂交和动物细胞融合比较
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
二、单克隆抗体及其应用
一个极富创造力的方案：
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
米尔斯坦【英国】
科勒【德国】
二、单克隆抗体及其应用
注射特定抗原
从脾脏中获取B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
与B淋巴细胞融合
诱导融合
第一次筛选
多种杂交细胞
选择培养基培养
培养骨髓瘤细胞
筛选杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
二、单克隆抗体及其应用
知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞。
资料：已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能合成DNA，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
培养基中加入
氨基喋呤
B淋巴细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
骨髓瘤细胞
合成DNA
D途径
能无限增殖
任务：请根据以上信息，设计一种方法，从培养液中筛选出杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
二、单克隆抗体及其应用
注射特定抗原
从脾脏中获取B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
培养骨髓瘤细胞
目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
与B淋巴细胞融合
诱导融合
第一次筛选
多种杂交细胞
选择培养基培养
筛选杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生抗体
特点
杂交瘤细胞
克隆化培养和抗体检测
96孔板培养和筛选
筛选抗体检测呈
阳性的杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生特异性抗体
特点
第二次筛选
二、单克隆抗体及其应用
阳性孔
抗体检测的方法——抗原 — 抗体杂交法
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养）
一段时间后，检测各孔
上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原
结合的培养孔为阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
在体外培养
注射到小鼠腹腔内
培养液中获取
从腹水中获取
筛选抗体检测呈
阳性的杂交瘤细胞
单克隆抗体
二、单克隆抗体及其应用
课堂小结
诱导其融合的方法有哪些？
注射特定抗原的目的是什么？
大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法
两次筛选的目的
获得能产生特定抗体的B淋巴细胞
物理：电融合法
第1次筛选：得到杂交瘤细胞（多种）。
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
多种B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射特定抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原—抗体杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
B细胞
瘤细胞
选择培养基
筛选1
化学：聚乙二醇 （PEG）融合法
生物：灭活病毒诱导法
第2次筛选：得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二、单克隆抗体及其应用
课堂小结
单克隆抗体制备过程中应用到的细胞工程技术手段
杂交瘤细胞特点
单克隆抗体的优点
原理
既可以产生抗体，又可以大量增殖
动物细胞融合、
动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
多种B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射特定抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原—抗体杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
B细胞
瘤细胞
筛选1
① 能准确地识别抗原的细微差异。
② 与特定抗原发生特异性结合。
③ 可以大量制备。
课堂小结
【两次筛选的比较】
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
筛选方法
筛选结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞。
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
筛选获得杂交瘤细胞
因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养基筛选获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌特定抗体的细胞
获得能分泌特定抗体的杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
二、单克隆抗体及其应用
资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的方法提前了10d左右。可以避免孕妇在知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成了不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
思考·讨论：单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
思考·讨论：单克隆抗体的应用
资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗，可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
二、单克隆抗体及其应用
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。也可以与一些作用于细胞信号转导通路的药物结合，可阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长。
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
思考·讨论：单克隆抗体的应用
优点：准确、高效、简易、快速。
二、单克隆抗体及其应用
2. 单克隆抗体的应用
① 作为诊断试剂——最广泛应用
② 用于治疗疾病和运载药物
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
a、特异性强、灵敏度高，可以大量制备。
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物+放射性同位素
b、位置准确、疗效高、毒副作用小。
艾滋病检测试剂
结合同位素的单抗
治疗B细胞淋巴瘤
【概念检测】
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
练习与应用
教材P51
C
二、单克隆抗体及其应用
【概念检测】
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
练习与应用
教材P51
A
二、单克隆抗体及其应用
【扩展应用】
2. 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
练习与应用
教材P51
二、单克隆抗体及其应用
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，日前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。

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