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高考生物二轮复习专题专练
（29）微生物的选择培养、鉴定和计数
从“高度”上研究高考
[典例]　(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。
培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基 Ⅰ 中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是______。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________(答出2种即可)等生物大分子。
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是______________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_____________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
菌株 透明圈大小
平板Ⅱ 平板Ⅰ
A ＋＋＋ ＋＋
B ＋＋ －
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是________________________________________________________。
[解析]　(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”形曲线增长，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一代数量的2倍，根据公式Nt＝N0λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路。(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
[答案]　(1)石油　DNA、RNA、蛋白质
(2)N0·2n　(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力　(4)A　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
从“深度”上提升知能
(一)选择培养基四种常见的制备方法
1．加入某些特定的物质
(前提是培养基具备全部营养成分)
2．改变培养基的营养成分
3．利用培养基“特定化学成分”分离
4．通过某些“特殊环境”分离
(二)辨析统计菌落数的两种方法
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝C/V×M。C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数，V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
从“宽度”上拓展训练
1．(2022·苏州一模)微生物的计数方法有多种，下列有关叙述错误的是(　 )
A．用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目时，可利用鉴别培养基培养后计数
B．用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际少
C．用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室
D．用已知密度红细胞悬液对待测菌液以比例计数法计数时，两种液体需混合均匀
解析：选B　测定饮用水中大肠杆菌的数目可取一定量的饮用水，之后按一定倍数稀释，再用加入伊红-亚甲蓝的鉴别培养基培养，对深紫色金属光泽菌落进行计数，A正确；平板划线法常用来筛选分离微生物，不用于计数，B错误；用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室，C正确；将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度，D正确。
2．(2022·琼海三模)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是嗜盐菌合成的一种胞内聚酯，可用于制造“绿色塑料”。从某咸水湖中获得高产PHA菌种的流程：①取样→②接种→③培养→④取单菌落培养→⑤检测PHA产量→⑥获得目标菌。下列叙述错误的是(　 )
A．②可用稀释涂布平板法接种到含PHA较高的选择培养基上
B．②所用培养基应加入琼脂以便挑取单菌落
C．③④要将培养皿倒置放入恒温箱
D．培养基用过后要灭菌处理
解析：选A　由题干信息分析可知，欲获得高产PHA菌种应将菌种在适宜其生长的培养基中培养，A错误；由流程分析可知，筛选出目的菌株，需要形成菌落，故使用固体培养基，即②所用培养基应加入琼脂以便挑取单菌落，B正确；③④要将培养皿倒置放入恒温箱，倒置培养能够防止培养基中的水分过快蒸发，又能防止冷凝形成的水珠落入培养基，C正确；培养基用过后要灭菌处理，防止污染环境或感染实验人员，D正确。
3．(2022·枣庄二模)自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是(　 )
A．步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B．步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C．1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个
D．所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂
解析：选C　由题图可知，步骤②振荡20 min的目的是让样品中的微生物充分释放到无菌水中并均匀分布，A错误；由题图可知，步骤④获得的菌落分散在平板上，利用的是稀释涂布平板法，使用的接种工具是涂布器，使用前需要灼烧灭菌，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)÷3÷0.1×104＝9.5×106个，C正确；由题干信息可知，该实验的目的是分离土壤中自生固氮菌和固氮能力的测定，自生固氮菌能够利用空气中的氮作为氮源，故培养基中不需要加入氮源，D错误。
[专题验收评价]
一、基础考法全面练
1．下列关于传统发酵技术及其应用的叙述正确的是(　 )
A．果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可适当延长
B．制作果醋利用了醋酸菌在无氧条件下产生乙酸的原理
C．制作泡菜利用乳酸菌发酵产生乳酸和CO2的原理
D．家庭制作泡菜无需灭菌是因为泡菜汤中的亚硝酸盐可杀死杂菌
解析：选A　果酒发酵后期，酵母菌无氧呼吸减弱，产生的二氧化碳减少，所以拧松瓶盖的间隔时间可适当延长，A正确；醋酸菌是好氧细菌，其发酵产生乙酸必须在有氧条件下进行，B错误；乳酸菌发酵产生乳酸，没有CO2，C错误；家庭制作泡菜无需灭菌是因为在发酵过程中，乳酸菌产生的乳酸可以抑制其他微生物的生长，D错误。
2．老坛酸菜，古称殖，《周礼》中就有其名。土坑酸菜是将芥菜倒到土坑里，这些芥菜并不清洗，放置好后加水、盐等，用薄膜包上，盖上土直接腌制。下面关于酸菜的制作叙述正确的是(　 )
A．土坑酸菜涉及食品安全问题，因为制作前没有清洗灭菌
B．老坛酸菜制作过程中需要严格密封
C．真空包装的酸菜会因为乳酸菌的大量繁殖而发生胀袋
D．由于酸菜腌制过程中会产生硝酸盐，因此酸菜腌制需要控制好时间
解析：选B　因为卫生不达标等原因，土坑酸菜涉及食品安全问题，A错误；酸菜制作的原理是乳酸菌发酵，故老坛酸菜制作过程中需要严格密封，B正确；乳酸菌的大量繁殖不会产生气体，不会胀袋，C错误；酸菜腌制过程中会产生亚硝酸盐，D错误。
3．(2022·德州三模)日常生活中的泡菜、酸奶、果醋等许多食物和饮品都是由发酵技术获得的。下列有关叙述正确的是(　 )
A．进行泡菜、酸奶、果醋发酵的微生物均通过有丝分裂进行增殖
B．泡菜制作过程中，泡菜坛内增加的液体主要由微生物代谢产生
C．家庭自制瓶装酸奶时，需对鲜奶进行高温灭菌，并定期拧松瓶盖
D．制作果醋时，可利用果酒作为醋酸菌发酵所需要的碳源
解析：选D　有丝分裂是真核生物体细胞的增殖方式，进行泡菜、酸奶发酵的菌种为乳酸菌，进行果醋发酵的菌种为醋酸菌，均为原核生物，进行二分裂，A错误；泡菜制作过程中，泡菜坛内增加的液体主要是植物细胞中的水，B错误；高温灭菌会破坏酸奶中的营养成分，且自制酸奶时利用的是乳酸菌，其代谢不产生气体，无需拧松瓶盖，C错误；果醋发酵的菌种为醋酸菌，可以利用酒精产生乙酸，D正确。
4．(2022·深圳模拟)某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的固体培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将5个手指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。下列相关叙述错误的是(　 )
A．这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有培养皿和培养基等
B．“将手指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的接种
C．从实验结果来看，洗手后的操作不会污染培养基
D．培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
解析：选C　为了防止杂菌污染，实验中需要进行灭菌处理的材料用具有培养皿和培养基等，A正确；由题干信息可知，该实验的目的是探究洗手前后细菌数量的变化，“将手指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的接种，B正确；从实验结果来看，洗手后的培养基中菌落较少，说明洗手后的操作仍会污染培养基，C错误；蛋白质和核酸都含有氮元素，故培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的，D正确。
5．培养基是人们按照培养对象对营养物质的不同需求配制的营养基质。下列有关培养基的配制和使用的叙述，正确的是(　 )
A．微生物培养基的组成成分必须含有碳源、氮源、水和无机盐
B．对动物的体细胞进行细胞培养，需要用固体培养基
C．接种前要了解固体培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测
D．使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃
解析：选D　微生物培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中不需加入氮源，A错误；动物的体细胞进行细胞培养用液体培养基，B错误；检测培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，C错误；使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃，D正确。
6．(2022·威海二模)研究人员从某地区的土壤中分离到一株能利用原油为碳源生长的细菌(BGQ-6)，该菌对原油的总降解率为74.14%，且对直链烷烃、支链烷烃、环烷烃和芳香烃等60种烃类有较高的降解率。下列说法错误的是(　 )
A．利用添加石油的普通培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ-6
B．可采用稀释涂布平板法对BGQ-6进行计数
C．一般选择菌落数为30～300的平板进行BGQ-6菌落计数
D．由单一的BGQ-6繁殖所获得的群体称为BGQ-6纯培养物
解析：选A　利用以石油为唯一碳源的选择培养基能从被石油污染的土壤中筛选BGQ-6，A错误；对微生物进行计数时，可选择的接种方法是稀释涂布平板法，B正确；为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，C正确；由单一的BGQ-6繁殖所获得的群体称为BGQ-6纯培养物，D正确。
7．解磷菌可以使土壤中难以利用的磷转化为植物易吸收的磷。某工厂生产解磷菌的企业标准是当发酵液中菌体的浓度为2×1011个/L时发酵结束，经处理后分装、质检、上市。下列说法错误的是(　 )
A．在农业生产中可将解磷菌作为微生物肥料
B．为保证活菌数量符合产品要求不宜采用显微镜直接计数
C．发酵结束前取0.2 mL发酵液涂布平板计数时，稀释度为10－7最合适
D．发酵结束后可采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥
解析：选C　解磷菌可以使土壤中难以利用的磷转化为植物易吸收的磷，因此在农业生产中可将解磷菌作为微生物肥料，A正确；显微镜直接计数时死菌和活菌均包含在内，且无法区分，保证活菌数量时不宜采用此方法计数，B正确；符合生产标准的发酵液中菌体的浓度为2×1011个/L，发酵结束前取0.2 mL发酵液涂布平板计数稀释度为10－7时，平板上的菌落数约为2×1011个/L×0.2 mL×10－7×10－3＝4(个)，不在30～300范围内，影响结果的准确性，因此稀释度为10－7不合适，C错误；发酵产品不同，分离提纯的方法一般不同，如果产品是菌体，可采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离和干燥，D正确。
8．(2022·山东高考，改编)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法不正确的是(　 )
A．用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B．焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C．糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D．通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
解析：选B　赤霉素能促进种子的萌发，据此可推测若用赤霉素处理大麦，可诱导α-淀粉酶相关基因的表达，促进α-淀粉酶的合成，进而使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A正确；焙烤是为了去除大麦种子中的水分，可以杀死大麦种子的胚，但是没有进行灭菌，B错误；糖浆经蒸煮(产生风味组分、终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌)、冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C正确；利用转基因技术可以改造酵母菌，可以减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，D正确。
二、重难考法强化练
9．兴趣小组为检测某品牌冰淇淋中大肠杆菌的数量是否超标，用培养细菌的基本培养基进行检测，在培养基上涂布适量的冰淇淋原液设为甲组，不涂布冰淇淋原液的培养基设为乙组，经过37 ℃、12 h培养，发现乙组生长有少量菌落，下列叙述错误的是(　 )
A．需增设一组涂布大肠杆菌的培养基作为对照组
B．初步判断乙组培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌落特征
C．计数时，应将甲组的菌落数减去乙组的菌落数以消除误差
D．以菌落数代表样品中的大肠杆菌数量，统计结果往往比实际值偏小
解析：选C　需增设一组涂布大肠杆菌的对照组，目的是检测该基本培养基能否培养大肠杆菌，A正确；由于菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌落特征，B正确；若乙组生长有少量菌落，则培养基不合格，需重新配制，不能用于计算，C错误；当两个或多个细胞连在一起时在平板上观察到的是一个菌落，因此统计结果往往比实际值偏小，D正确。
10．(2022·镇江模拟)为处理工业污水中一种有害、难降解的有机化合物A，研究团队配制培养基，成功筛选出能高效降解化合物A的目的菌，主要步骤如图所示。下列相关叙述错误的是(　 )
A．为筛选目的菌，培养基应以化合物A为唯一碳源
B．实验中振荡培养若干天的目的是增加培养液中菌体数量
C．可用稀释涂布平板法对振荡培养后化合物A含量最少的锥形瓶进行选择接种
D．将固体培养基中得到的目的菌重复多次培养的目的是获得更多的菌种
解析：选D　该实验的目的是获得高效降解有机化合物A的目的菌，故培养基应以化合物A为唯一碳源，以获得目的菌，A正确；振荡培养能够使细菌与营养物质充分接触，利于细菌生长和繁殖，可增加培养液中菌体数量，B正确；由题干信息可知，目的菌具有降解有机化合物A的作用，所以培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量最少的培养基进行选择接种，C正确；将固体培养基中得到的目的菌重复多次培养的目的是对菌种“纯化”，D错误。
11．微生物M可产生乳糖酶催化乳糖水解，在工业生产中具有重要价值。如图为利用微生物M制备乳糖酶的步骤。下列相关叙述错误的是(　 )
―→―→
A．常采用干热灭菌法对筛选、培养微生物M的培养基进行灭菌
B．筛选产乳糖酶的微生物M时，培养基应以乳糖作为唯一碳源
C．欲在实验室培养获得纯净的微生物M，关键是要防止杂菌污染
D．乳糖酶催化乳糖水解产物是半乳糖和葡萄糖，在水浴加热条件下与斐林试剂反应呈砖红色
解析：选A　筛选和培养微生物M所用的培养基常采用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；产乳糖酶的微生物M能分解乳糖，因此筛选产乳糖酶的微生物M时，培养基应以乳糖作为唯一碳源，B正确；欲在实验室培养获得纯净的微生物M，关键是要防止杂菌污染，C正确；乳糖酶催化乳糖水解产物是半乳糖和葡萄糖，半乳糖和葡萄糖都属于还原糖，还原糖在水浴加热条件下与斐林试剂反应呈砖红色，D正确。
12．(2022·桃城区一模)反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气(2NO＋10e－＋12H＋→…→N2O→N2)，在处理工业污水、治理水体富营养化中具有重要作用。科研人员想从一污水处理厂的活性污泥中筛选分离出耐高温(42 ℃)的反硝化细菌(目的菌)，用于提升温度较高的工业污水的脱氮效率，具体流程如图所示(BTB培养基初始pH＝6.8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色)：
(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是________________________________________________________________。
(2)将污泥样品梯度稀释后，使用________(填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基上，放在____________环境中培养2～3天后，挑选周围显____色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将纯菌株接种在液体培养基上培养一段时间，若在培养瓶顶部检测到N2O，即可鉴定为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是____________________________。
(4)为保持纯化后的微生物菌种的纯净，需要对菌种进行保藏。临时保藏的方法具有______________________________________等缺点，它比较适合那些使用频率高的菌种的保藏。
(5)C/N(碳氮含量比)对反硝化效率有一定的影响。科研人员测得不同C/N条件下目的菌对硝酸盐的去除率，结果如图所示：
科研人员提出，在利用目的菌株处理工业污水时，需要适当向污水中投放少量淀粉，据图分析这样做的主要目的是______________________________________________。
(6)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为__________个。
解析：(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发。(2)将污泥样品梯度稀释后，使用涂布器将样液均匀涂布在BTB培养基上，由题干信息可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，科研人员欲筛选分离出耐高温(42 ℃)的反硝化细菌，故需要放在无氧、42 ℃环境中培养2～3天，根据反硝化过程的产物可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，反应过程中消耗培养基中的H＋，因此会导致菌落周围为弱碱性呈蓝色，应挑选周围显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。(3)不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，这是因为其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低。(4)为保持纯化后的微生物菌种的纯净，需要对菌种进行保藏。临时保藏的方法具有保存时间短、容易被污染或产生变异等缺点，它比较适合那些使用频率高的菌种的保藏，若要长期保存菌种，可采用甘油管藏法。(5)由题图信息分析可知，在一定范围内，目的菌株对硝酸盐的去除率随着培养液中的C/N升高而升高，据此推测，用反硝化细菌进行污水处理过程中，有时需要向污水中加入少量淀粉，其主要目的是提高污水中的C/N，以提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率。(6)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为(155＋160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109(个)。
答案：(1)防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发　(2)涂布器　无氧、42 ℃　蓝　(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低　(4)保存时间短、容易被污染或产生变异　(5)适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率　(6)1.6×109

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