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(共48张PPT)
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
学习目标
1.运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。（生命观念）
2.关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。（社会责任）
3.探究DNA的物理与化学性质， 进行DNA分子的提取与鉴定。（科学探究）
自主预习·悟新知
合作探究·提素养
深化拓展·育技能
一、基因工程的概念
别称 重组DNA技术
操作水平 ①__________水平
技术手段 转基因等技术
目的 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的②____________________
DNA分子
生物类型和生物产品
自主预习·悟新知
二、重组DNA技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
（1）来源：主要是从③__________中分离纯化出来的。
（2）作用：能够识别双链DNA分子的④________________，并且使每一条链中特定部位的⑤____________断开。
（3）结果：产生黏性末端或⑥______端。
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
平末
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）种类：
比较 连接酶 连接酶
来源 ⑦__________ ⑧___________
特点 只能连接⑨__________ 既可以连接黏性末端，又可以连接⑩________
（2）作用结果：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的
____________。
大肠杆菌
噬菌体
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）作用：将外源基因送入受体细胞。
（2）常用种类：质粒、噬菌体、 ____________等。
（3）质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 ______________分子。
动植物病毒
环状双链DNA
（4）作为载体的质粒需具备的条件：
a.质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供 __________________________其中。
b.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到 __________上，随受体DNA同步复制。
c.质粒DNA分子上有特殊的标记基因，便于 ____________________。
d.对受体细胞无害。
外源DNA片段（基因）插入
受体DNA
重组DNA分子的筛选
三、DNA的粗提取与鉴定
1.提取DNA的思路：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 ________________方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.提取DNA的原理
（1）DNA不溶于酒精，而某些 ________可溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的 溶液中溶解度不同，它能溶于 的 溶液。
3.鉴定DNA的原理
在沸水浴的条件下，DNA与 ________试剂反应呈现蓝色。
物理和化学性质
蛋白质
二苯胺
4.方法步骤
任务1 探讨重组DNA技术所需要的两种工具酶
活动1 探究限制性内切核酸酶——“分子手术刀”的种类和作用
已知限制酶 和 识别的碱基序列和酶切位点分别为&2& 和&3& ，分析回答：
合作探究·提素养
1.在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
2.写出产生的末端类型。
提示 ①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。
3.限制酶 和 的识别和切割是否说明了酶的专一性？
提示 虽然两种酶识别的碱基序列不同，切割位点也不同，但均是在特定位点切割DNA，仍说明限制酶具有专一性。
4.为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测限制酶在原核生物中的主要作用是什么？限制酶会不会切割自身的DNA分子？
提示 原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自身的DNA分子，因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上。
认知生成
限制酶拓展
1.来源：限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2.判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转 ，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。
3.特点：①主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的；②只能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；③只能在特定的部位进行切割。
4.结果：形成黏性末端或平末端。
5.实质：使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
例1 [2022·日照期中] 限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶。限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端或平末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端或平末端的DNA片段。据图分析错误的是( )。
D
A.图示三种黏性末端分别由不同的限制酶切割产生
B.甲与乙的黏性末端相同可形成重组DNA分子，甲与丙不能
C.DNA连接酶的作用位点是 处，能催化磷酸二酯键的形成
D.催化甲形成的限制酶能识别由甲、乙形成的重组DNA分子
[解析] 切割产生甲的限制酶的识别序列为 切割产生乙的限制酶的识别序列为 ，切割产生丙的限制酶的识别序列为 ，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶切割产生的，A正确；甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，C正确；切割甲的限制酶的识别序列为 ，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为 ，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D错误。
1.限制酶是一类酶而不是一种酶。
2.限制酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。
3.不同种类的限制酶识别的序列与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。
4.限制性内切核酸酶可用于切割DNA以获取目的基因，也可用于切割载体。
5.在切割含目的基因的DNA分子时，需在目的基因的两端都用限制酶切割，使目的基因的两端都有可连接的末端。
6.两个末端若是由同一种限制酶切割产生的，则两片段连接后还具有该种限制酶的识别序列和切割位点。
易错辨析
对点练1 [2022·常德质检] 下表为几种限制酶的切割位点，相关叙述不正确的是( )。
限制酶
识别序列及切割位点
A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键
B. 切割的序列一定能被 切割
C. 切割的序列一定能被 切割
D.以上信息说明限制酶没有专一性
D
[解析] 限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端，A正确； 识别的序列为&5& ， 识别的序列为&6& ，后者识别序
列中包含前者，因此 切割的序列一定能被 切割，B正确； 识别序列包含 的识别序列，因此 切割的序列一定能被 切割，C正确；一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列后进行切割，以上信息说明限制酶有专一性，D不正确。
活动2 探究DNA连接酶——“分子缝合针”的种类和作用
1.常用的DNA连接酶主要有哪两类？
提示 一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离得到的，称为 连接酶。
2.DNA连接酶的作用是什么？
提示 能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
3.以 碱基序列为例，尝试用图解的形式表示DNA连接酶与限制酶之间的关系。
提示
限制酶是断裂磷酸二酯键，DNA连接酶是连接磷酸二酯键，二者作用部位相同，作用效果相反。
例2 [2022·青岛月考] 下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( )。
A.将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键
B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，而不能连接平末端
B
[解析] DNA连接酶的作用是将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键，其中 连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，B正确。
基因工程中用到的酶
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个
DNA分子
耐高温的DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA（水解）酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
知识拓展
名称 作用部位 作用底物 作用结果
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链RNA末端
续表
对点练2 [2022·台州期中] 下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )。
C
A.DNA连接酶、限制性内切核酸酶、解旋酶
B.限制性内切核酸酶、解旋酶、DNA连接酶
C.解旋酶、限制性内切核酸酶、DNA连接酶
D.限制性内切核酸酶、DNA连接酶、解旋酶
[解析] ①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制性内切核酸酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。综上所述，C符合题意。
任务2 探讨基因工程操作的载体——“分子运输车”需要具备的条件
活动3 了解载体，探讨载体需要具备的条件
1.细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示 ①化学本质不同：细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒（DNA），也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。②功能不同：细胞膜上的载体的功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体的功能是把外源基因导入受体细胞。
2.质粒是什么
提示 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
3.天然的质粒可以直接用作基因工程载体吗？为什么？
提示 不能。载体需具备以下条件：能在受体细胞中稳定存在并自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因；对受体细胞无害。
1.作为载体必须具备的条件
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）带有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
（4）对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生命活动。
归纳总结
2.常用载体的种类及用途
种类 用途
质粒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
噬菌体 植物病毒 将外源基因导入植物细胞
动物病毒 将外源基因导入动物细胞
例3 [2022·长沙检测] 下列关于质粒的说法，不正确的是( )。
A.质粒存在于细菌和酵母菌等生物的细胞中
B.质粒DNA分子中每个磷酸基团都连着两个脱氧核糖
C.不同的质粒DNA， 的值一定相同
D.质粒是基因工程中常用的工具酶
D
[解析] 质粒是环状DNA分子，故其分子中每个磷酸基团都连着两个脱氧核糖，B正确；因质粒是双链DNA分子，根据碱基互补配对关系 、 可知，不同的质粒DNA中， 的值一定相同，均为1，C正确；质粒是基因工程中常用的工具（载体），而非工具酶（工具酶是限制酶和DNA连接酶），D不正确。
1.载体的作用
（1）作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞内。
（2）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在受体细胞内进行自我复制。
2.标记基因的筛选原理
（1）前提：载体上的标记基因一般是某些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
（2）过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性；然后将受体细胞放在加入该抗生素的培养基中培养。
易错辨析
（3）结果：在培养基上，不能生存的是没有抗性基因的受体细胞，能够生存的是具有抗性基因的受体细胞。
（4）原理如下图所示：
对点练3 限制酶 和 的识别序列及切割位点分别是&7& 和&8& 。下图表示四种质粒和目的
A
A.&9& B.&10& C.&11& D.&12&
基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )。
[解析] 用限制酶 切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体，A符合题意；B质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B不符合题意；C质粒含有标记基因，但用限制酶 切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，C不符合题意；D质粒含有标记基因，但用限制酶 切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，D不符合题意。
任务3 探讨DNA的粗提取与鉴定的原理
活动4 通过实验操作，探讨DNA的粗提取与鉴定的原理
1.提取DNA分子的基本思路是什么？
提示 DNA分子的粗提取是利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异进行提取的。
2.动植物细胞是否都可以作为实验材料？若使用动物细胞作为实验材料，使用鸡血而不用猪血的原因是什么？
提示 都可以。猪的成熟红细胞没有细胞核，不易提取到DNA。
3.DNA和蛋白，质在 溶液和酒精中的溶解度是怎样的？
提示 DNA在不同浓度的 溶液中溶解度不同，它能溶于 的 溶液；DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质可溶于酒精。
4.提取过程中使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是什么？
提示 DNA会吸附在滤纸上，使用纱布过滤而不用滤纸过滤的目的是减少DNA的损失。
5.用冷却的酒精析出DNA的过程中，应如何使用玻璃棒搅拌？这样操作的目的是什么？玻璃棒上缠绕的白色丝状物的主要成分是什么？
提示 沿一个方向轻轻搅拌，玻璃棒不要触及烧杯壁和烧杯底。目的是防止破坏DNA。白色丝状物的主要成分是DNA。
认知生成
根据DNA的溶解性判断DNA的去向
1.DNA在 的 溶液中溶解，过滤后要保留滤液。
2.DNA在 的 溶液中析出，过滤后要保留黏稠物，舍弃滤液。
3.DNA在加入体积分数为 的预冷的酒精溶液中析出，用玻璃棒卷起丝状物即可，不用过滤。
例4 [2022·盐城期中] 关于DNA的粗提取与鉴定实验的各步骤操作目的的表述，错误的是
( )。
A.离心沉淀的血细胞中加水是为了使血细胞破裂从而提取DNA
B.加入物质的量浓度为 的 溶液，是为了溶解DNA
C.向溶解有DNA的 溶液中加蒸馏水是为了洗涤DNA，除去杂质
D.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
C
[解析] 离心沉淀的血细胞中加水是为了使血细胞破裂释放DNA，从而提取DNA，A正确； 溶液的物质的量浓度为 时，DNA溶解，B正确；向溶解DNA的 溶液中加蒸馏水是为了降低 溶液的浓度，从而使DNA析出，C错误；在一定温度（沸水浴）下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，D正确。
1.加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA的量就会减少。
2.粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质等。
3.析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
4.实验中出现的丝状物的主要成分是DNA，实际上每一根“丝”都是由许多DNA分子聚集在一起形成的，应用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，避免破坏DNA。
5.为减少DNA的损失，一般使用纱布进行过滤。
知识拓展
对点练4 [2022·大连期中] 利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时，下列操作正确的是
( )。
A.研磨液需用滤纸进行过滤，以保证提取到更多的DNA
B.向上清液中加入体积分数为 的冷酒精后，DNA会与蛋白质分离并析出
C.将晾干的丝状物置于 的 溶液中会发生溶解现象
D.利用DNA在低温下遇二苯胺试剂呈蓝色的特性对其进行鉴定
C
[解析] DNA会吸附在滤纸上，为保证提取到更多的DNA，研磨液需用纱布进行过滤，而不是用滤纸过滤，A错误；应加入体积分数为 的冷酒精，使DNA与蛋白质分离并析出，B错误；DNA在 的 溶液中溶解度较大，将晾干的丝状物置于 的 溶液中，会发生溶解现象，C正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，D错误。
[2022·石家庄联考] 下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：
深化拓展·育技能
（1） 代表的物质和质粒的化学本质相同，都是______________（写中文名字）。自然情况下大肠杆菌可能发生的可遗传变异有__________。
脱氧核糖核酸
基因突变
[解析] 代表的物质是拟核中的DNA分子，质粒是细胞质中的DNA分子，二者都是环状DNA分子，化学本质都是脱氧核糖核酸。大肠杆菌属于原核生物，自然情况下可能发生的可遗传变异是基因突变。
（2）下列常在基因工程中用作载体的是___（填字母）。
A.苏云金杆菌抗虫基因 B.土壤农杆菌环状RNA分子
C.大肠杆菌的质粒 D.动物细胞的染色体
C
[解析] 大肠杆菌的质粒是基因工程中常用的载体。
（3）氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为__________，其作用是_______________________________________ _。
标记基因
用于目的基因（或重组质粒）的鉴定和筛选
[解析] 质粒上的氨苄青霉素抗性基因是标记基因，可用于目的基因（或重组质粒）的鉴定和筛选。
（4）若质粒DNA分子的切割末端为&13& ，则与之连接的目的基因切割末端应为
_ ___________；切割形成以上片段的限制酶的识别序列是_______________________。可使用
____________把质粒和目的基因连接在一起。
DNA连接酶
[解析] 根据碱基互补配对原则，目的基因的切割末端应为&16& ；目的基因与质粒形成重组DNA需要用到DNA连接酶。切割形成题示片段的限制酶的识别序列是&17& 。
（5）某种限制酶识别的序列及切点为&18& ，那么含该序列的DNA片段被切割后形成的结果是_ ________________。
[解析] 某种限制酶识别的序列及切点为&20& ，那么含该序列的DNA片段被切割后形成的结果是&21& 。

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