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第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
学习目标
1.结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维）
2.运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。（生命观念）
自主预习·悟新知
合作探究·提素养
深化拓展·育技能
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指①____________的基因。
2.筛选合适的目的基因：较为有效的方法是从相关的已知②________________的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）PCR原理：③________________原理。
（2）PCR的基本条件：需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和④____________________。
编码蛋白质
结构和功能清晰
DNA半保留复制
耐高温的DNA聚合酶
自主预习·悟新知
（3）扩增过程：
（4）结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即呈 ______形式扩增（约为 ， 为扩增循环的次数）。
指数
二、基因表达载体的构建
1.构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 ________________。
表达和发挥作用
2.组成：除目的基因、标记基因外，它还必须有 ________、终止子等。
启动子
3.构建过程：用同种限制酶或 ________________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用 ____________将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成一个重组DNA分子。
能产生相同末端
DNA连接酶
三、将目的基因导入受体细胞
1. 转化的概念：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 ________________的过程。
2.填表
生物类型 导入方法 受体细胞 注意事项
植物 我国独创的 ______________；农杆菌转化法 受精卵或体细胞 农杆菌转化法一般适用于
____________和 __________
动物 ____________ ________ —
微生物 ______处理法 原核细胞 常用 __________
维持稳定和表达
花粉管通道法
双子叶植物
裸子植物
显微注射法
受精卵

大肠杆菌
（1）农杆菌的特点：在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；含有 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 质粒上的 _________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法的原理：将 __________插入 质粒的 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。

目的基因
四、目的基因的检测与鉴定
1.个体水平检测
（1）检测内容：是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。
（2）检测方法：转基因生物的抗性接种实验，比较基因工程产品与天然产品的功能活性。
（3）结果显示：是否赋予了预期抗性或蛋白质活性。
2.分子水平检测
检测内容 检测方法 结果显示
目的基因是否插到受体细胞的 DNA上 通过PCR等技术检测（DNA和DNA之间） 是否成功显示出杂交带
目的基因是否转录出mRNA 通过PCR等技术检测（DNA和mRNA之间） 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交（蛋白质和蛋白质之间） 任务1 探讨获取目的基因的方法
活动1 讨PCR的原理、过程
获取目的基因是实施基因工程的第一步，目前获取目的基因的常用方法有利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因等。聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识，回答下列问题：
合作探究·提素养
1.什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
提示 引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的 端延伸DNA链，因此PCR过程中应加入两种引物。
2.PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
提示 不需要，只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列，以便根据这部分序列合成两种引物。
3.PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
提示 PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
4.PCR过程中设计引物时引物的碱基能否互补？
提示 不能。引物需要分别与模板DNA分子的每一条单链互补，如果2种引物的碱基序列互补，那么会影响引物与DNA单链的结合。
5.PCR过程中若模板DNA分子中 碱基对含量较多，则变性时间会怎样？
提示 若模板DNA分子中 碱基对含量较多，则DNA分子中的氢键较多，破裂氢键需要能量增多，变性时间会延长。
6.引物是单链还是双链 是短DNA链还是短RNA链 引物结合到DNA模板链的 端还是 端
提示 引物是一小段能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，可以是DNA，也可以是RNA，通常含20~30个核苷酸；引物是从模板链的 端与之结合的。
7.PCR反应的特点是DNA呈指数形式扩增。PCR的产物一般是通过什么方法来测定的
提示 琼脂糖凝胶电泳。
认知生成
1.生物体内DNA复制与PCR反应的比较
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的 端开始延伸，都是连续合成的
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
过程 边解旋，边复制 变性→复性→延伸
循环次数 受生物体自身控制 一般30次
产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段
相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则 续表
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）实验原理
①PCR扩增原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳鉴定原理：DNA分子具有可解离的带电（正电荷或负电荷）基团，在电场的作用下，这些分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
（2）实验流程
步骤 主要操作
配制反应体系 用微量移液器按照PCR反应体系的配方，在微量离心管中依次加入各组分
设置反应程序 参照相应参数，设置好PCR仪的循环程序
进行PCR反应 将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应
制作琼脂糖凝胶 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液→熔化→加入适量核酸染料→倒入模具、插入梳子并凝固
电泳 电泳槽中加入电泳缓冲液→注入PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液→通电电泳
观察结果 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
例1 [2022·南阳期中] 有关PCR，下列叙述不正确的是( )。
A.是聚合酶链式反应，是以DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B.在用PCR扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸
C
[解析] 聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术，A正确；在用PCR扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，B正确；PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸及耐高温的DNA聚合酶等，C不正确；PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段，D正确。
PCR中与引物有关的五个易错点
1.设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷酸序列。
2.引物与模板链结合以及子链的延伸都是有顺序的，如引物的 端与模板的 端结合，子链从引物的 端 端延伸。
3.两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物：①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠；②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。
易错辨析
4.为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的 端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物上设计加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。
5.复性温度与设计的引物（长度、碱基组成）有关：①长度相同但 含量高的引物需要设定的复性温度较高；②若复性温度过高，则会破坏引物与模板的结合，可能导致PCR反应得不到任何扩增产物。
对点练1 [2022·天津月考] 利用PCR扩增目的基因的过程中，子链延伸需要引物。有关引物设计的说法错误的是( )。
A.两种引物之间不能有互补性
B.每种引物自身不应存在互补性
C.设计引物时需要知道目的基因的全部碱基序列
D.引物的长度关系到PCR的特异性
C
[解析] 两种引物之间不能有互补性，否则引物之间会配对形成双链DNA，降低引物与DNA模板的结合率，A正确；每种引物自身不应存在互补性，防止引物自身折叠形成双链DNA，B正确；用PCR扩增目的基因时不必知道基因的全部碱基序列，只需要知道一段已知目的基因两端的部分核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物即可，C错误；引物的长度关系到PCR的特异性，引物中碱基越少，PCR的特异性越差，D正确。
任务2 探讨将目的基因导入受体细胞的方法
活动2 探讨农杆菌转化法
1.基因工程操作的核心程序是什么 启动子的化学本质是什么 其作用是什么
提示 基因工程操作的核心程序是基因表达载体的构建；启动子的化学本质是DNA；其作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 ，最终表达出人类所需要的蛋白质。
2.为了获得转基因生物，在将目的基因导入受体细胞的程序中，动物一般不用体细胞作为受体细胞，而是用受精卵作为受体细胞，植物的体细胞和受精卵都可作为受体细胞，为什么
提示 与细胞的全能性有关，动物的体细胞较难表现出全能性，动植物的受精卵以及植物的体细胞表现出来全能性相对容易些。
3.目的基因为什么不能直接导入受体细胞而是需要使用载体
提示 游离的DNA分子进入细胞内，一般会直接被分解，即使可以进行转录、翻译，游离的DNA也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
4.农杆菌侵染植物细胞后，能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上的物质是什么
提示 质粒上的 （可转移的DNA）。
5.请用文字和箭头的形式表示农杆菌转化法的一般步骤。
提示 目的基因插入 质粒的 中→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
6.基因工程常用原核生物作为受体细胞的原因是什么？其中以哪种生物最为广泛？
提示 原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。大肠杆菌应用最为广泛。
例2 农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。下图为农杆菌转化法示意图，请据图回答问题：
（1） 质粒多存在于细菌中，它是能自我复制的__________________。
小型环状DNA分子
（2）获取外源基因（目的基因）需要限制酶的参与，而目的基因在重组过程中需要__________酶的参与，并依据碱基__________原则进行重组。
DNA连接
互补配对
（3） 质粒原存在于______________中，其上的 具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的____________上的特点，因此携带外源基因的DNA片段必须插入
______________________部位。
农杆菌细胞质
染色体DNA
片段（内部）
（4）农杆菌转化法适于将目的基因导入____________和祼子植物，而不易于感染大多数
____________。
双子叶植物
单子叶植物
（5）若将相关的目的基因导入动物细胞或微生物细胞，则常采用______________和
____________。
显微注射技术
处理法
[解析] 将目的基因导入受体细胞的方法多种多样，应根据受体细胞的类型和目的基因的特点分别采用相应的方法。农杆菌转化法适于将目的基因导入植物细胞，而显微注射技术和 处理法分别适于将目的基因导入动物细胞和微生物细胞。
1.在自然条件下，农杆菌主要侵染的是双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
2.由导入目的基因的受体细胞培育出完整的植株要用到植物组织培养技术。
知识拓展
3.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别，如下图所示。
（1）图中 会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞减数分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性。
（2）图中 细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
对点练2 [2022·台州期中] 基因工程的受体细胞可以是细菌、动物或者植物细胞，因此将目的基因导入受体细胞的方法也有所差异。下列叙述错误的是( )。
A.导入植物细胞常采用农杆菌转化法
B.将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中可以避免目的基因随花粉传播
C.大肠杆菌作为受体细胞时，通常需要使用 处理
D.显微注射可以将目的基因直接注射给动物体受精卵
D
[解析] 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法等，A正确；将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中可以避免目的基因随花粉传播，B正确；将目的基因导入微生物细胞，如大肠杆菌时，常用感受态细胞法，即需要使用 处理大肠杆菌细胞，使之成为感受态细胞，C正确；显微注射是将含目的基因表达载体的DNA溶液注射给动物受精卵，D错误。
[2022·徐州期中] 我国科学家领衔的团队利用 等技术，将人的亨廷顿舞蹈病致病基因（ 基因）第1外显子“敲入”猪基因组内，获得了人—猪“镶嵌” 基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈病的动物模型。回答下列问题：
（1）PCR技术是获得人 基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲溶液中分别加入人 基因模板、脱氧核苷酸及__________________________等，最后补足 。
引物和耐高温的DNA聚合酶
[解析] PCR技术需要的条件：基因模板、脱氧核苷酸、引物和耐高温的DNA聚合酶等。
深化拓展·育技能
（2） 基因编辑技术中，向导RNA准确引导 蛋白切割与识别序列配对的靶基因DNA序列，如图所示。由此可见， 蛋白在功能上属
________________酶。向导RNA中的双链区遵循 _____________原则，与目标DNA相比，特有的碱基
限制性内切核酸
碱基互补配对


对是______。若 链剪切位点附近序列为 ，则相应的识别序列是
___________________。
[解析] 可以切割与向导RNA配对的靶基因DNA序列，由此可见， 在功能上属于限制性内切核酸酶。向导RNA的双链区遵循碱基互补配对原则，与DNA相比，向导RNA双链区特有的碱基对是 。若 链剪切位点附近序列为 ，则与向导RNA中的识别序列配对的DNA的另一条链的碱基序列是 ，故向导RNA中的识别序列是 。
（3）在实验过程中，为确认实验猪细胞基因组内是否含有人—猪“镶嵌” 基因，常用
______技术检测。
PCR
[解析] 常用PCR技术检测猪细胞基因组内是否含有目的基因。
（4）含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加。当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为__________。贴满瓶壁的细胞常用__________________________进行消化处理，以便进行______培养。
接触抑制
胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）
传代
[解析] 当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。贴满瓶壁的细胞常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶进行消化处理，使其分散成单个细胞，以便进行传代培养。
（5）将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为
________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈病动物模型。
核移植
[解析] 将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为核移植。

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