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(共17张PPT)
二轮微专题—
基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
【情境原理】
1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治疗和物种改良。
2.应用最广泛的技术:CRISPR/Cas9
3.CRISPR/Cas9组分及功能:
短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”,部分序列通过碱基互补配对,与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合,切割与向导RNA结合的DNA,使DNA双链断裂
4.CRISPR/Cas9技术的主要应用:
(1)基因敲除。
(2)特异突变引入。
(3)定点转基因。
5.CRISPR/Cas9技术的风险:
(1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
(2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规,不能违反人类的伦理道德。
【典例突破1】基因组编辑技术是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部特定片段,是一种对生物体基因组特定目标基因进行修饰的技术。如图是对某生物B基因进行基因编辑的过程,该过程中用sgRNA指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的靶位点。下列相关叙述错误的是(　　)
A.sgRNA的全部碱基序列与靶基因序列完全互补B.限制性内切核酸酶Cas9可断裂核苷酸之间的磷酸二酯键C.根据上述处理前后生物体的功能变化,可推测B基因的功能D.使用该项基因组编辑技术来预防人的某些疾病时需要审批
A
【解析】据图观察sgRNA的部分碱基序列与靶基因序列互补,A错误;
【变式训练】
1.CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,
当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过sgRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9蛋白切断目标DNA,从而起
到防御作用。下列关于该机制的叙述正确的是(　　)
A.噬菌体DNA的变化体现了基因突变的不定向性
B.sgRNA与目标DNA结合片段中最多含有5种核苷酸
C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.高倍光学显微镜可观察到该现象
C
8种
属于特定位点的切割,不是基因突变
属于分子水平的改变,光学显微镜下无法观察到该现象
2.CRISPR/Cas9基因组编辑技术源于对细菌抵御噬菌体的机理研究。细菌被特定噬菌体感染后,细菌Cas2会随机切断入侵的噬菌体DNA双链,并将切下的一个DNA片段①(原型间隔序列)插入CRISPR位点的重复序列中,构成新的间隔序列(由间隔序列和重复序列交替排列组成的基因序列),形成“免疫记忆”。当同种噬菌体再次入侵时,由CRISPR位点的新的间隔序列转录产生的crRNA便会将另一种蛋白质(如Cas9)准确带入入侵者的原间隔序列DNA处,并将之切断②,即“免疫灭杀”。CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,sgRNA(单向导RNA)是根据靶基因设计的引导RNA,准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列③,CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时,对DNA序列中的原型间隔序列相邻基因序列具有较高的编辑效率,如图所示。回答下列问题:
(1)细菌Cas2基因表达Cas2的过程需要细菌提供　　　　　　　　　　　等原料,Cas2和Cas9在功能上都属于　　　　　　　,可催化　　　　　　　　(填化学键)水解。
(2)CRISPR/Cas9系统中的sgRNA与细菌体内的　　　　　　　功能相同,都可以与相应靶基因序列发生碱基互补配对。细菌利用该防御机制可以有效抵抗噬菌体的二次入侵,但是仍然会有部分噬菌体能够继续侵染已经获得免疫能力的宿主菌,原因可能是　 　 。
(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术存在一定的脱靶效应:正常情况下,sgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点,然而有时会发生第18~20个碱基不匹配的情况④,此时,Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA-DNA双链⑤,从而为Cas9切割DNA铺平道路,但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA,从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应,提出可能的思路: 　 。
(1)核糖核苷酸和氨基酸　限制性内切核酸酶(限制酶)　磷酸二酯键 　(2)crRNA　 噬菌体DNA中的原型间隔序列发生基因突变,导致CRISPR位点形成的crRNA无法对其进行识别　(3)设计Cas9酶,让其手指状结构远离DNA序列,从而在sgRNA和DNA错配时,不会用来稳定错配结构(或sgRNA的长度可设计为17个碱基,避免第18~20个碱基不匹配时,导致错误位点的切割)
(4)研究证实,人低氧诱导因子(HIF-1α)表达水平与肝癌的发生发展具有密切关系,HIF-1α在肝癌细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞⑥,使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除HIF-1α基因为肝癌治疗提供了新途径。科研人员构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9重组质粒,并用重组质粒对肝癌细胞进行转染,利用其敲除肝癌细胞中的HIF-1α基因,并通过12孔板筛选获得了基因敲除的混合克隆细胞株,然后用HIF-1α表达诱导剂(CoCl2)诱导相关细胞,提取蛋白,用Westernblot法(分离检测蛋白质的一种方法)检测HIF-1α蛋白的表达,以相应条带灰度值(越大)表示表达水平(越高)⑦。下图为三类细胞HIF-1α蛋白的检测结果:
请尝试分析图示实验结果及结论: 　 。
未转染的细胞经CoCl2诱导后可见明显的HIF-1α表达,而转染的混合克隆细胞经CoCl2诱导后HIF-1α未见明显表达,表明HIF-1α基因敲除成功
①首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生而来）进行杂交；
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，并进行筛选和鉴定。
1.不依赖PCR的定点突变技术—寡核苷酸引导的突变的技术
寡核苷酸：一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称
M13噬菌体是一种丝状噬菌体，
内有一个环状单链DNA分子
一、基因定点突变技术
（1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物
引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。
②分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR，得到两个DNA片段
③得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。
④最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
2．PCR定点突变技术
知识拓展：基因定点突变技术
1.（不定项）重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增。从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方而具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是（ ）
A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高
B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生4种双链DNA分子
D．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过3次复制
AB
典型突破2
变式训练
D
（2）大引物PCR
①大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。
②首先利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；
③利用第一轮扩增产物片段中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA
选择哪条链作为下游大引物？
定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要_________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的_________（填“①”或“②”）。
2
②
典型突破3
2.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是__________________________________________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要_____________________等酶。
SmaI的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接
Bgl Ⅱ、DNA连接酶
2.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和______________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是_________。
β-半乳糖苷
构建改良基因组质粒时破坏了LacZ基因(因)，含该质粒的大肠杆菌不能分解β-半乳糖苷产生蓝色物质（变），菌落为白色（果）
通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是（ ）
A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq酶等
B．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体
D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C
变式训练

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