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(共26张PPT)
The basic operating procedures of genetic engineeringy
基因工程的基本操作程序
第3课时
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3
01
1、实验原理
利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
(1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的 ，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
(2)PCR扩增DNA片段还利用了
的原理。一次PCR一般要经历 次循环。
DNA的热变性
温度
解聚与结合
DNA半保留复制
30
5’-
-3’
3’-
-5’
3’-
-5’
5’-
-3’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
3’-
-3’
高温
变性
延伸
复性
低温
中温
1次循环
(1)带电粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，这些基团可以带上____________。
(2)迁移动力与方向：在____的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是_____。
(3)迁移速度：PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________、_____________和____等有关。
(4)检测：凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的_______下被检测出来。
01
实验原理
DNA片段电泳鉴定的原理：
可解离的基团
正电荷或负电荷
电泳
相反
电场
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
（呈负相关）
琼脂糖凝胶电泳
2
1
了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
目的要求
试剂
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
用具
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
微量移液枪
PCR仪
电泳装置
注意：加不同样品时，需要更换枪头
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
DNA片段的扩增
第一部分
方法步骤
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
1.PCR加样
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
2.离心
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
3.扩增
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
DNA片段的电泳鉴定
第二部分
方法步骤
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
4.配置琼脂糖溶液
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，
以形成加样孔。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
5.制备凝胶
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
6.电泳加样
凝胶载样缓冲液类似层析液
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
7.电泳、观察
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
注意
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
结果分析与评价
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，
请分析产生这个结果的可能原因。
结果分析与评价
一.概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
√
×
×
练习与应用
练习与应用
一.概念检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
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