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(共44张PPT)
The basic operating procedures of genetic engineeringy
基因工程的基本操作程序
第1课时
普通棉花
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
苏云金杆菌
制成
杀虫剂
掌握目的基因的功能
掌握目的基因的结构
防治棉花害虫
发现杀虫作用与Bt基因有关
掌握Bt基因的序列
深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
培育转基因抗虫棉的简要过程
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
目录
CONTENTS
基因表达载体的构建
目的基因的筛选与获取
1
2
目的基因的筛选与获取
8
01
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因。
如何筛选目的基因？
一、目的基因
概念
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白在起作用。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
二、筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
DNA测序仪
明确了目的基因后，该怎么获得它
序列数据库（如GenBank）
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
序列比对工具（如BLAST）
认识基因结构和功能的技术方法
从基因文库中获取
01
利用PCR获取和扩增目的基因
03
通过DNA合成仪直接合成
02
三、目的基因的获取方法
①基因文库的构建过程
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
②基因文库类型
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
从基因文库中直接获取
②基因文库类型
（1）基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
用适当
限制酶切割
许 多
DNA片段
该生物
基因组文库
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
与载体连接
导入受体菌群
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
(cDNA)
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，
cDNA文库中的基因不含以上结构。
与载体连接
导入受体菌群
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
某一发育时期
基因组文库
从细胞中提取DNA
细胞
基因组DNA
质粒
质粒酶切
DNA连接酶连接
限制酶酶切
导入细菌中
基因组文库克隆
提取
酶切的DNA片段
cDNA文库
逆转录
逆转录酶
酶切的cDNA片段
限制酶酶切
质粒
质粒酶切
连接
导入细菌中
cDNA文库克隆
提取
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
（1）前提：
（2）方法：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
通过DNA合成仪直接合成
01
苏云金杆菌
Bt基因
？
快速获得大量Bt基因
PCR——聚合酶链式反应
原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
提取
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
利用PCR获取和扩增目的基因
1.概念：
①____：DNA的两条链。
②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
③原料：A、T、G、C四种___________________。
④酶： 酶。
⑤其他条件：
需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。
模板
引物
脱氧核苷酸(dNTP)
耐高温的DNA聚合
缓冲
2.条件：
PCR反应需要在一定的
缓冲溶液中才能进行
4种脱氧核苷酸(dNTP)
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量。
提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
1.概念：
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
2.作用：
引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
3.结合部位：
引物结合在模板链的_________。
3’端
4.PCR扩增时至少需要___种引物，原因是______________________________________________________
2
DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增
引物的相关知识
5.PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物
第1步：变性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
当温度超过90℃时，
双链DNA解旋为单链。
95℃
3.过程：
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
3.过程：
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
3.过程：
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5′-
-3′
3′-
5’
3′-
-5′
5′-
-3′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
3.过程：
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列
结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
耐高温的DNA聚合酶
引物的3 ′端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
变性：加热至90℃以上，___________________;
复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；
延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行
互补链的合成。如此重复循环多次。
双链DNA解聚为单链
50
耐高温的DNA聚合酶
过程归纳
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的
碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
RNA链
DNA链
思考：扩增几次可以得到只含目的基因的片段？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
(1)1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段。经过 次循环后，刚好得到所需的目的基因;
(2)若开始有N个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。　　　　
N 2n
3
4.结果：
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而
每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即呈_____形式扩
增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8
含引物的DNA分子数 2 4 8
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6
2n
2n
2n－1
2n－2
2n－1
2n－2n
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用＿＿＿＿＿＿来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
5.产物鉴定：
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
5.产物鉴定：
基因表达载体的构建
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
获得目的基因后直接转入受体吗？
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代;
使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用。
1、基因表达载体的作用
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
2、基因表达载体的组成
3.基因表达载体构建的流程
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
质粒
重组
DNA分子
目的基因与运载体的结合过程，
实际上是不同来源的基因重组的过程。
3.基因表达载体构建的流程
注意：
1、目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。
2、目的基因的插入不能破坏标记基因。
3、切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。（碱基互补，便于连接）
基因表达载体的构建
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