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第4节
蛋白质工程的原理和应用
SW-PWF
第3章　基因工程
从社会中来
你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
科学家解析了多管水母绿色荧光蛋白的晶体结构，并利用计算机进行辅助设计，在此基础上再采用定点突变的技术将绿色荧光蛋白发光基团正下方的第203位的苏氨酸替换为酪氨酸，从而获得了一种新的绿色荧光蛋白的衍生物——黄色荧光蛋白。
用细菌“画”的画
(1)基础：蛋白质分子的 及其与_________的关系。
(2)操作方法和对象： 。
(4)目的： 的蛋白质或 的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(5)地位：在_________的基础上,延伸出来的第 代基因工程。
(6)学科和技术： 。
改造或合成基因
分子生物学、晶体学和计算机技术
一、蛋白质工程的概念及其理解
蛋白质工程
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
结构规律
生物功能
基因工程
二
改造现有
制造一种新
将一种生物的____转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的______，进而表现出________。
二、蛋白质工程崛起的缘由
2.基因工程的不足:
3.蛋白质工程崛起的缘由:
1.基因工程的实质:
基因
蛋白质
新的性状
基因工程原则上只能生产自然界_______的蛋白质。
已存在
天然蛋白质是生物在 过程中形成的，它们的结构和功能符合
的需要，却不一定完全符合人类 的需要。
长期进化
特定物种生存
生产和生活
二、蛋白质工程崛起的缘由
4.实例:
对天然酶的改造：玉米中赖氨酸含量较低，经人工设计改造，可使其叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。
赖氨酸合成
调控
达到一定浓度
两种酶的活性
352位的苏氨酸变成异亮氨酸
二氢吡啶二羧酸合成酶
天冬氨酸激酶
+
104位的天冬酰胺变成异亮氨酸
赖氨酸含量
抑制
提高
提高
限制
提高
三、蛋白质工程的基本原理
1.蛋白质工程的目标:
2.蛋白质工程的实质:
根据人们对蛋白质_____的特定需求，因此要对蛋白质的_____进行设计改造。
功能
结构
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过 来完成。
蛋白质工程的操作对象是基因还是蛋白质，为什么？
改造或合成基因
3.天然蛋白质合成过程：
天然蛋白质合成的过程是按照________进行的。
中心法则
基因
表达
形成具有特定氨基酸序列的多肽链
形成具有高级结构的蛋白质
形式生物功能
转录和翻译
4.蛋白质工程思路:
从_______________出发→设计______________→推测____________ →找到并改变___________________或_________→获得所需要的蛋白质
蛋白质工程与天然蛋白质合成的过程_____。
预期功能
生物功能
设计
蛋白质
（三维结构）
推测
改造或合成
转录
翻译
折叠
行使
目的基因
mRNA
多肽链
相反
预期的蛋白质功能
预期的蛋白质结构
应有的氨基酸序列
相对应的脱氧核苷酸序列
合成新基因
注意：蛋白质工程是在分子水平上的操作
三、蛋白质工程的基本原理
5.蛋白质工程的常用技术:
蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型；
要制备蛋白质晶体，然后通过X射线衍射技术，分析晶体的结构；要用到基因的定点突变技术来进行碱基的替换。
学科交叉
三、蛋白质工程的基本原理
你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？
旁栏思考题
人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域重大的国际合作科研项目。2001年，国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年，该组织正式提出启动两项重大国际合作项目：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”；由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。
“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院土牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划。它的目标是通过对肝脏蛋白质高通量、规模化的研究,解析肝脏蛋白质在生理、病理过程中的功能意义，为重大肝病的预防、诊断、治疗和新药的研发提供重要的科学依据。2010年，该计划“两谱、两图、三库”的目标初步实现。我国科学家完成了人类肝脏蛋白质组表达谱和修饰谱，绘制了蛋白质相互作用连锁图和定位图。“三库”则是建立符合国际标准的肝脏标本库、发展规模化抗体制备技术并建立肝脏蛋白质抗体库和建立完整的肝脏蛋白质组数据库。人类蛋白质组计划取得的成果有力推动了蛋白质工程的发展，为它提供了重要的理论支持。2014年6月，中国人类蛋白质组计划启动。
讨论
1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。
---蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
思考·讨论
GCU
GCC
GCA
GCG
UGG
AAA
AAG
丙氨酸
…
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙
氨酸
…
UUU
UUC
GAA
GAG
---蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
思考·讨论
讨论：
1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。
GCU
GCC
GCA
GCG
UGG
AAA
AAG
丙氨酸
…
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙
氨酸
…
UUU
UUC
GAA
GAG
GCU(或C或A或G) UGG AAA(或G) GAA(或G） UUU(或C)
mRNA序列
脱氧核苷酸序列
GCT(或C或A或G) TGG AAA(或G) GAA（或G） TTT(或C)
CGA(或G或T或C) ACC TTT(或C) CTT（或C） AAA(或G)
共___种可能序列
32
一个氨基酸是由一个或多个密码子决定,因此获得的基因总的碱基序列有多种。
---蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
思考·讨论
讨论：
2. 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
GCU
GCC
GCA
GCG
UGG
AAA
AAG
丙氨酸
…
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙
氨酸
…
UUU
UUC
GAA
GAG
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
6.蛋白质工程和基因工程的比较
思考：如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？
6.蛋白质工程和基因工程的比较
是否合成新的基因
蛋白质工程
是否对原有基因进行改造
是
否
是
否
蛋白质工程
基因工程
看蛋白质
看基因
是否为天然蛋白质
是
否
蛋白质工程
基因工程
四、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面:
(1)研发速效胰岛素类似物:
速效胰岛素
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期结构
改造
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
转录
mRNA
折叠
预期功能
行使功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20-29位氨基酸组成
推测序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
科学家通过改造 实现对相应氨基酸序列的改变,使B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的 。
胰岛素基因
聚合
四、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面:
(2)延长干扰素体外保存时间:
天然干扰素不易保存
预期结构
改造
一个半胱氨酸变成丝氨酸
新干扰素基因
转录
mRNA
折叠
预期功能
行使功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
推测序列
翻译
多肽链
在-70℃下可以保存半年
将干扰素分子上的一个 变成 ，在一定条件下，可以延长保存时间。
半胱氨酸
丝氨酸
半胱氨酸
丝氨酸
四、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面:
(3)降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应:
解决办法：通过_________，将小鼠抗体上________的区域（即________）“嫁接”到_________（即_______）上，经过这样改造的抗体__________________________；
医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低。
改造基因
结合抗原
可变区
人的抗体
恒定区
诱发免疫反应的强度就会降低很多
四、蛋白质工程的应用
2.其他工业方面:
蛋白质工程被广泛用于 或 。
开发新的工业用酶
改进酶的性能
枯草杆菌蛋白酶
枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。迄今为止，利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。
五、蛋白质工程的现状
蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为
。
由计算机建立的血红蛋白三维结构模型
三级结构
一级结构
四级结构
二级结构
2.前景展望：
科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂
1.现状：
四、蛋白质工程的应用
3.农业方面:
(1)改造某些_________________的酶,提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
(2)利用蛋白质工程的思路 ，通过改造 的结构，使它防治病虫害的效果增强。
参与调控光合作用
设计优良微生物农药
微生物蛋白质
伊维菌素是新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药
能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的宿主细胞中，让宿主细胞生产人类所需要的蛋白质食品呢？
理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。利用改造后的动物细胞、微生物细胞等可以生产人类需要的蛋白质，但这些蛋白质往往都是自然界中已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来的、自然界中不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对大多数蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能了解得还不够，很难设计出一个全新的而又具有功能的蛋白质。即使设计并获得了一个全新的蛋白质，它的生理生化特性、用它生产的蛋白质食品的安全性等都需要长期深入的研究。
思考：
到社会中去
酶制剂在食品工业、医药工业等方面都有广泛的应用。现在，酶制剂的生产已经形成一个市场可观的新兴产业。蛋白质工程的应用又为酶制剂产业的发展提供了强大助力。请查阅资料，了解我国酶制剂产业发展的现状和趋势，分析蛋白质工程在酶制剂产业中的作用。
酶用作工业催化剂，比无机催化剂具有更大的优越性，主要体现在以下几个方面。由于酶促反应能在常温、常压和中性pH条件下进行，因此可以节省大量的能源和设备投资；生产过程中不会造成严重的污染，符合环境保护的要求；生产过程简单、效率高，产品质量好，生产成本低。因此，酶制剂在工业领域得到了广泛的应用。近年来，通过引进国外先进设备、优良菌种以及开发新型酶制剂，我国酶制剂产业保持了较快的增长态势，品种越来越丰富，产品的市场竞争力也在不断提升。2016年，我国工业酶制剂年产量达120万吨，年增长率保持在10%左右。在全球范围内，我国酶制剂的市场份额已占到了30%左右，我国进入酶制剂生产大国的行列。在酶制剂产业中，蛋白质工程被广泛用于开发酶的新品种或改进酶的性能，如提高酶的热稳定性，增加某些被用作去污剂的酶的去污效率等。
蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
一、蛋白质工程崛起的缘由：基因原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符号特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
二、蛋白质工程的基本原理：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面；2.其他工业方面；3.农业方面。
课堂小结
1. 蛋白质工程可以说是基因工程的延伸。判断下列相关表述是否正确。
(1)基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。（ ）
(2)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。（ ）
(3)蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。（ ）
√
×
×
一、概念检测
练习与应用
2. 蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到 的目的是 （ ）
A. 分析蛋白质的三维结构
B. 研究蛋白质的氨基酸组成
C. 获取编码蛋白质的基因序列信息
D. 改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求
3. 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第 47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这 项替换研究中，目前可行的直接操作对象是（ ）
A.基因 B.氨基酸　　C.多肽链 D.蛋白质
D
A
练习与应用
T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴？在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么？如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作？
二、拓展应用
这项工作属于蛋白质工程的范畴。引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需要重新明确,包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产成本等。
练习与应用
谢谢观看！
基因的定点突变技术1——重叠PCR
三
蛋白质工程的基本原理
补充
①该过程需要___种引物；
②PCR1的产物AB是引物___和引物___扩增的结果；
③PCR2的产物CD是引物___和引物___扩增的结果；
④产物AD的形成需要引物吗？_______________________
⑤需要改变的碱基位于引物___和引物___上
⑥引物b和引物c之间有什么关系？_________________
⑦PCR3中突变产物AD的扩增需要引物___和引物___
4
a
b
c
d
b
c
引物b和引物c应有部分碱基互补
a
d
不需要，需要耐高温的DNA聚合酶
三
蛋白质工程的基本原理
现学现用：
利用重叠PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，过程如下图，下列分析正确的是（ ）
A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增
的结果
B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基
C.①过程需要先加热至90-95℃再冷却至55-60℃
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
ABC
三
蛋白质工程的基本原理
基因的定点突变技术2——大引物PCR
该过程需要三条引物，第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条链作为下游大引物，与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段；
三
蛋白质工程的基本原理
补充
基因的定点突变技术3
三
蛋白质工程的基本原理
补充
基因定点突变技术和基因突变的比较
定点突变 基因突变
相同点 类型
结果
不同点 场所
手段
方向
产生新基因
生物体外
生物体内
PCR技术
诱变因素
定向改造
不定向性
碱基对的增添、缺失、替换
三
蛋白质工程的基本原理
补充

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