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(共40张PPT)
怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。 P67
棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。
情境材料一
普通棉花
转基因抗虫棉
苏云金杆菌
毒蛋白基因
毒蛋白
杀死害虫
怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？ P67
情境材料一
什么是基因工程？ P67
别名
操作环境
操作对象
操作水平
结 果
原 理
优 点
重组DNA技术
生物体外
基因
符合人类需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状
DNA分子水平
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
P68-69
第3章基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
本节聚焦
重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
基因工程载体需要具备什么条件？
P70 从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）
科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识別双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3'端的羟基与另ー个DNA片段5'端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。
情境材料二
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜 P70
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
情境材料二
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
1.简称： 。
限制酶
2.来源：
主要是从 中分离纯化出来的。
3.种类： 种。
4.特点：
识别 的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
原核生物
数千
双链DNA分子
磷酸二酯键
5.作用部位： 。
磷酸二酯键
限制酶不是一种酶，而是一类酶
特异性
1’
2’
3’
4’
5’
G
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
P71 旁栏思考题
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
74 练习与应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
4.下列有关基因工程中限制酶的描述,正确的是(　　)
A.限制酶只能识别6个或8个脱氧核苷酸组成的序列
B.限制酶的活性受温度的影响
C.限制酶能识别和切割RNA
D.限制酶只能从原核生物中提取 《金版学案》P117
B
6.识别序列长度:
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
6.识别序列长度:
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切割形成 末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
7.作用结果:
形成黏性末端和平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
8.识别序列的特点：
(2)限制酶所识别的序列，呈碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
(1)限制酶具有专一性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
(3)同一种限制酶一定能切出相同的粘性末端，相同的粘性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
回文序列
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”P71
限制酶名字的由来
P72 资料卡
是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如：
大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶: 。
EcoRⅠ
5.下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点,切口为黏性末端),下列叙述正确的是 (　　) 《金版学案》P118
限制酶2:
限制酶3:
限制酶4:
A.限制酶1和3切出的黏性末端相同
B.限制酶1、2、4识别的序列都由4个脱氧核苷酸组成
C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
D.限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4 DNA连接酶拼接
限制酶1:
A
……CTACGATGAATTCC..........GTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCAT..........CTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCC..........GTAG
GGCAT..........CTTAA
黏性
末端
目的基因
用EcoRI剪切目的基因
1.要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？
2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
会产生相同的黏性(平)末端
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
黏性
末端
目的基因
用EcoRI剪切目的基因
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
二、DNA连接酶——“分子缝合针” P72
2.作用：
将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的__________。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
1.概念：
能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
两个DNA片段
3.种类和差别：
类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 ____________ ____________
功能 只缝合____________ 缝合____________和____________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
P72 旁栏思考题
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么
DNA连接酶
A
G
T
A
C
T
A
A
T
DNA母链
DNA聚合酶
DNA聚合酶
T
…
…
T
…
…
A
…
…
A
…
…
T
…
…
A
…
…
T
…
…
C
…
…
…
G
…
…
…
P72 旁栏思考题
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
10.(2021·广东)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是 (　　)
A.用限制酶切割获得一个目的基因时得到2个切口,有2个磷酸二酯键被断开
B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.序列-CATG↓-和-G↓GATCC-被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
9.下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 (　　)
A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
《金版学案》P118
B
C
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”P72
1.作用：
2.种类：
将 送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
外源基因
在基因工程中使用的载体包括 等。
质粒、噬菌体和动植物病毒
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
动物病毒
噬菌体
3.常用载体：质粒
拟核DNA
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制起点
大肠杆菌及质粒结构模式图
(1)化学本质：是一种裸露、结构简单、独立于 或________________
外，具有 能力的 。
真核细胞细胞核
原核细胞拟核DNA
自我复制
环状双链DNA
(2)基因工程中使用质粒的特点：在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过__________的。
人工改造
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”P72
4.作为载体需具备的条件：
拟核DNA
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制起点
大肠杆菌及质粒结构模式图
(1)有一个至多个 ，供外源DNA片段（基因）插入其中。
限制酶切割位点
(2)能够在宿主细胞中 或整合到 上，随受体DNA同步 。
自我复制
受体DNA
复制
(3)具有特殊的 ，便于重组DNA分子的 。
标记基因
筛选
(4)对受体细胞无害、易分离，大小合适、方便操作。
标记基因通常有：
①抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。
②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”P72
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
重组DNA分子
P73 思考·讨论
请你在上述序列中EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。
讨论1 : 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
P73 思考·讨论
重组DNA分子
讨论2: 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
讨论3 : 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能。
因为基因通常是有遗传效应的DNA片段；其长度一般在100个碱基对以上。
8.下列有关DNA连接酶的说法,正确的是 (　　)
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段,也能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段 《金版学案》P118
A
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在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。
P73 到社会中去
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
一、概念检测
P74 练习与应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
XbaⅠ 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
P74 练习与应用
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
一、实验原理
1.提取DNA的原理
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，对它们进行提取。
(1)DNA 酒精，某些蛋白质 酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(2)DNA在不同浓度的 中的溶解度不同，它能溶于 的NaCl溶液。
不溶于
溶于
NaCl溶液
2mol/L
2.鉴定DNA的原理
在一定温度下（沸水浴），DNA遇 试剂会呈现 。
二苯胺
蓝色
当NaCl浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0.14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
二、目的要求：
1.了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及利用二苯胺试剂对DNA 进行鉴定。
三、材料用具：
1.材料：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）
洋葱
花菜
香蕉
猪肝
鸡血
菠菜
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
2.试剂及作用：
(1)研磨液
(2)体积分数为95%的酒精
(3)2mol/L 的NaCl溶液
(4)二苯胺试剂
(5)蒸馏水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L，从而析出DNA
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
离心机 电子天平
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、剪刀
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
四、方法步骤：
1.研磨洋葱:
研磨洋葱
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL ，充分研磨。
2.过滤获取含DNA的上清液:
过滤取上清液
方案一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取 。
方案二：也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取 放入烧杯中。
研磨液
上清液
上清液
目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
上清液中除DNA之外，可能含有核蛋白、多糖等杂质
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
DNA的粗提取与鉴定
P74 探究和实践
四、方法步骤：
3.冷却酒精析出DNA:
方案一：在上清液中加入体积相等的、 溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
方案二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
用冷却的酒精析出DNA
预冷的酒精
白色丝状物
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
DNA的粗提取与鉴定
P75 探究和实践
四、方法步骤：
4.DNA的鉴定：
取两支20mL的试管，各加入 溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的 。混合均匀后，将试管置于 中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
DNA的鉴定
对照组如何设计？
2mol/L的NaCl
二苯胺试剂
沸水
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
实验组
对照组
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关
DNA的粗提取与鉴定
P75 探究和实践
(1)选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
(2)猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
(3)如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
编号 溶液名称 操作 获得溶液
1 研磨液 搅拌研磨后过滤 滤液E
2 浓度为2 mol/L的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液F
3 浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液G
4 预冷的体积分数为95%的酒精溶液 搅拌后过滤 滤液H
6.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。请分析并回答下列问题。
(1)图中实验材料A可以是　　　　等,研磨
前加入的B应该是　　　 　　　　　。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后, 再向滤
液中加入体积分数为95%的预冷的酒精的目的是　　　　　 　　　　。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中,将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中,经搅拌后
过滤,获得如下表所示的4种滤液,其中
含DNA最少的是滤液　　 　　。
(4)DNA鉴定的原理是　 。
在沸水浴加热条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
洋葱(或菜花)
研磨液
溶解蛋白质,初步分离DNA和蛋白质
H
《金版学案》P123
3.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的操作及原理的叙述,正确的是 (　　)
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破以获取含DNA的滤液
B.向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA
C.控制NaCl溶液的浓度可以实现去除杂质的目的
D.DNA在酒精溶液中析出时,用玻璃棒轻缓搅拌,会使析出的DNA量减少
选项 试剂 操作 作用
A 柠檬酸 钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞液混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入溶有DNA的NaCl溶液中 析出蛋白质
D 预冷的 酒精 加入过滤后含DNA的NaCl溶液中 产生特定的颜
色反应
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 (　　)
《金版学案》P123
C
A

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