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在上述传统发酵食品：利用天然菌种，存在菌种差异、杂菌情况不明、发酵过程控制缺乏标准、易造成发酵食品品质不一。
传统发酵食品制作过程中存在的问题
工业大规模生产：先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵，从而缩短发酵时间，确保品质稳定。
改善
一、发酵与传统发酵技术
第2节 微生物的培养技术及应用
一 微生物的基本培养技术
二 微生物的选择培养和技术
第1章 发酵工程
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
微生物：
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
微生物：
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
微生物的类群
病毒：新冠病毒等RNA病毒；
噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌等；
放线菌：链霉菌等
单细胞真菌：酵母菌、霉菌等；
原生生物：草履虫、衣藻等
微生物结构简单、形体微小，有没有可能不借助显微镜观察到微生物类群？
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
从社会中来
实验室培养微生物的条件:
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
——培养基
——无菌技术
一、要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
二、要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
01培养基的配置1.培养基的概念:2.培养基的作用:3.培养基的类型:人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。(1)按物理性质：液体培养基、固体培养基。(2)按化学组成：天然培养基、合成培养基。(3)按目的用途：选择培养基、鉴别培养基。
实验室常用培养基之一
固体培养基
液体培养基
加入凝固剂
（如琼脂）
分离、鉴定、计数和菌种保存等。
扩大微生物种群数量
琼脂是一种从红藻中提取的多糖。
琼脂在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。
(1)按物理性质：液体培养基、固体培养基。
(2)按化学组成：天然培养基、合成培养基。
含化学成分不明确的天然物质，常用于工业生产。
天然培养基：
培养基成分明确，常用于分类、鉴定。
合成培养基：
(3)按目的用途：选择培养基、鉴别培养基。
选择培养基
鉴别培养基
培养、分离出特定微生物
鉴别不同种类微生物
加入青霉素：可分离出酵母菌、霉菌等真菌；
不加氮源：可分离出固氮微生物；
不加含碳有机物：可分离出自养型微生物；
加入过量NａCｌ，可分离出金黄色葡萄球菌；
加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌（若有，菌落呈黑色，并带有金属光泽）
加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌（若有，则出现透明圈）
a．选择培养基：将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
b．鉴别培养基：用于鉴别不同类型的微生物
选择培养基
鉴别培养基
01
培养基的配置
4.培养基的营养成分:
（1）基本成分：
碳源、氮源、无机盐、水
碳源
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
自养微生物
异养微生物
功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。
氮源
无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。
含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
无机盐
功能：提供无机营养
调剂PH
维持渗透压
水
功能：良好的溶剂
维持生物大分子结构的稳定
牛肉膏
蛋白胨
牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。
蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
H2O 定容至1000ml
1.分析该培养基的营养构成，上述实例属于固体/液体培养基？
碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
无机盐
水
碳源、氮源和维生素等
牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）
（2）特殊条件：
pH、O2和特殊营养物质
例： 1、培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
2、培养霉菌时，需要将培养基调制酸性；
3、培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性；
4、培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件
01
培养基的配置
4.培养基的营养成分:
生长因子：氨基酸、维生素、碱基等
“个性定制”
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
H2O 定容至1000ml
碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
无机盐
水
碳源、氮源和维生素等
(1)培养基中加入琼脂的目的是提供碳源(　　)
(2)所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(　　)
(3)培养不同微生物的培养基成分完全一样(　　)
1.判断正误
×
×
×
2．如果大肠杆菌培养基里不添加琼脂，大肠杆菌的生长情况是
A．正常生长 B．无法存活
C．少数能存活 D．无法判断
√
3．下表为培养酵母菌所用培养基中的部分成分，其中主要提供氮源的是
A．琼脂 B．黄豆粉 C．葡萄糖 D．黄豆粉和琼脂
√
02
无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染！
无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括
消毒和灭菌。
02
无菌技术
1.消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
操作的空间、操作者的衣着和手
用于培养微生物的器皿、接种用具和培养基
生物消毒法：利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。
-----与消毒最本质区别
2.灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
防止外来微生物污染
避免操作者被微生物感染
02
无菌技术——消毒
类型 适用范围 操作方法
消 毒
较为温和方法，杀死部分微生物。
煮沸消毒
家庭餐具等生活用品
100℃煮沸5～6min
巴氏消毒
牛奶等不耐高温的液体
62～65℃消毒30min或80-90℃消毒30s-1min
化学药剂消毒
生物活体（皮肤、伤口）、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、
用氯气消毒水源
紫外线消毒
紫外线照射30min
接种室、接种箱，超净工作台
在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
02
无菌技术——灭菌
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。
基本保持培养基的营养成分不被破坏。
注意：
①使用前必须先将锅内冷空气排尽，才能达到预设的压力和温度。
②灭菌完成时，待锅内压力自然降到０时，再打开气阀。
①湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方式
高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌法（效果最好）：
100kPa、121℃下维持15-30min。常用于培养基、无菌水等的灭菌。
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
02
无菌技术——灭菌
②干热灭菌：
干热灭菌箱内160～170 ℃下加热2～3h。
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和
原生质干燥等。
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌。
干热灭菌箱
02
无菌技术——灭菌
③灼烧灭菌：
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如涂布器、接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
酒精灯火焰灼烧
连一连：物品所对应的灭菌或消毒方法
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药剂消毒
紫外线消毒
巴氏消毒法
02无菌技术 还要注意：避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。超净工作台(1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染(　　)
(2)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(　　)
(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用干热灭菌法进行灭菌(　　)
1.判断正误
√
√
×
2.关于消毒、灭菌的方法，下列描述错误的是
A.接种用的无菌操作台要进行灭菌处理
B.用巴氏消毒法处理牛奶是因为高温易破坏牛奶的营养成分
C.煮沸半小时后的凉开水中可能仍含有部分芽孢和孢子
D.先喷洒消毒液，再用紫外线照射可增强消毒效果
√
微生物的纯培养
03
1.培养物：
3.纯培养：
2.纯培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
配置培养基
灭菌
接种
分离
培养
操作步骤：
念珠菌显色培养基
大肠杆菌培养基
酵母菌培养基
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1.实验原理：
(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落
(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
一个单菌落就是一个种群
单菌落
获得单菌落的方法？
问
①平板划线法 ②稀释涂布平板法
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
特征：
大小、形状、隆起程度、颜色等
功能：
鉴定菌种的重要依据
单个微生物
固体培养基上
大量繁殖
子细胞群体
单菌落
在相同培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
灭菌
倒平板
配制培养基
制备培养基
A、配制培养基
1、制备培养基
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1、制备培养基
B.灭菌
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1、制备培养基
C、倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
以免空气中的杂菌污染培养基
既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可以使培养基表面的水分更好地挥发。
2、接种和分离酵母菌
平板划线法
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
酵母菌的纯培养
1
2
3
4
5
【平板划线法注意事项】
1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
2.划线首尾不能相接；
3.每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
4.划线操作结束后，仍需灼烧接种环。
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
问
问题思考与分析：
灼烧的顺序 目的
第一次灼烧
每次划线之前灼烧
划线结束灼烧
杀死接种环上原有微生物，避免杂菌的污染
杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死残留菌种，避免污染环境、感染操作者
1）留意接种环灭菌的注意事项。2）划线的注意事项。3、酵母菌培养
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-48h。
用记号笔标记培养皿中菌落皿底上
未接种的平板作为对照组，
若其上有菌落生长，则说明培养基被污染或者灭菌不彻底。
警示：在实验室中，切记不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
【探究和实践】 酵母菌的纯培养
1. 在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
结果分析与评价：
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
2. 在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状 和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
本节小结
配置培养基
灭菌
接种和分离
培养
倒平板
一、概念检测
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
练习与应用
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
二、拓展应用
练习与应用
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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