资源简介

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第2节
微生物的基本培养技术及应用
微生物的选择培养和计数
第2课时
选择培养基
Selective medium
01
微生物的数量测定
Determination of the number of microorganisms
03
习题巩固
Exercises to consolidate
04
微生物的选择培养
Selective culture of microorganisms
02
CONTENS
目录
PART ONE
选择培养基
简|约|水|彩|通|用|模|板
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
该怎么办呢？
选择培养基应运而生。
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
讨论：1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，
而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
温泉
冰川
油田
利用这种原理制作的培养基就是选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
概念
分离酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
分离固氮微生物
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物
②不加氮源
①加入青霉素
种类
分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）。
作用
+氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
选择培养基
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收 。
细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成脲酶。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
现学现用
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是______________________，
。该类培养基的主要用途为 。
固体
且比例为1.5%~2%
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
PART TWO
微生物的选择培养
02
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：
获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：
测定分解尿素的细菌的数量
概念：将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。
微生物的选择培养
稀释涂布平板法
主要过程:
A、梯度稀释菌液
B、涂布平板
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落
梯度稀释菌液
选择培养基的制备
01
对土壤样品进行稀释
02
①原理：
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
1、选择培养基的制备
1、选择培养基的制备
②配方：
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
a、提供无机盐
b、调节PH
2、对土壤样品进行稀释
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
（1）土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）样品的稀释
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
涂布平板
涂布平板操作
03
培养并观察培养基菌落
04
3、涂布平板操作
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
4、培养并观察培养基菌落
待涂布的菌液被 后，将平板 ，放入 中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1~2
合适浓度
单菌落
恒温培养箱
细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。
培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？
问
答
培养未接种的培养基的作用是对照。
未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？
问
答
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
注意事项
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
常用微生物分离方法比较
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
PART THREE
微生物的数量测定
计数：测定分解尿素的细菌的数量
显微镜直接计数法
01
稀释涂布平板法
02
直接计数法
间接计数法
1、显微镜直接计数法
①原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
②缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
③优点：
a.快速、直观。
④计数方法：
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。
（“染色排除法”）
2、稀释涂布平板法
当样品的稀释度足够 时，培养基表面生长的一个 ，来源于 中的一个 。通过计数平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。
①原理：
高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目
②计数原则:
（1）选择菌落数为 的平板计数。
（2） 稀释度下，应 对 个平板进行重复计数，
然后求出 。
（3）统计的菌落往往比活菌的实际数目 。
（4）统计的结果一般用 而不是活菌数。
30~300
同一
至少
3
平均值
低
菌落数
因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落。
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
③计算公式:
M代表稀释倍数（10n）
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
③计算公式:
M代表稀释倍数（10-n）
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)÷M
例题.某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )个
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
练一练
234
0.1
× 106 =2.34 ×109个
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
探究实践
实验目的
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
研究思路
1）土壤取样
2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
3）样品稀释与取样涂布
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液
测放线菌：一般用103、104、105稀释液
测真菌数：一般用102、103、104稀释液
思考
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板
1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），
4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基：
以验证培养基中是否含有杂菌。
4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
注意事项
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
5）结果分析与评价
结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落？
问
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
答
5）结果分析与评价
你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30～300的平板？
在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
问
如果得到了两个或多个菌落数为30~300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
答
5）结果分析与评价
你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
问
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
答
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
6）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
需要用“鉴别培养基”
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
红
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况。
固体培养基：
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌
刚果红培养基鉴别纤维素分解菌
项目 选择培养基 鉴别培养基
原理 加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌 可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)
图示
尿素分解菌
大肠杆菌
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
PART FOUR
习题巩固
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。
（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
WATERCOLOR
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