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3.2基因工程的基本操作程序
【学习目标】
1.【生命观念】通过对抗虫棉案例的学习，阐述基因工程的基本操作程序主要包括哪些步骤。
2.【科学探究】尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
【课前预习15min】
一、第一步：目的基因的筛选与获取
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤:(1)目的基因的 。(2) 。(3)将目的基因 。(4)目的基因的 。
2．目的基因
(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于 就是目的基因。
(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指 。
(3)实例：培育转基因抗虫棉用到的 ，即 基因。
3．筛选合适的目的基因：从 中进行筛选是较为有效的方法之一。
4．获取目的基因的方法
(1) 目的基因。
(2)常用 地快速扩增目的基因。
(3)通过 来获取目的基因。
5．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)含义：PCR是 的缩写。它是一项在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的 进行大量复制的技术。
(2)原理： 。
(3)基本条件
①场所：在一定的 中进行，其中一般要添加 。
②模板：DNA母链。
③原料： 。
④酶： 酶。
⑤引物：使DNA聚合酶能够从 开始连接脱氧核苷酸。
(4)过程
①变性：当温度 ℃时，双链DNA 为单链。
②复性：当温度下降到 ℃左右时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：当温度 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(5)鉴定：常采用 来鉴定PCR的产物。
二、第二步：基因表达载体的构建——核心步骤
1．基因表达载体构建的目的:让目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够 。
2．基因表达载体的组成
3.基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的 切割载体。
（2）然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用 酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
三．第三步：将目的基因导入受体细胞
(1)将目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法：
a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。
b．在植物 的一定时间内，剪去柱头，将 滴加在花柱切面上，使目的基因 。
②农杆菌转化法
a．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 的过程。
b．农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 (可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
(2)将目的基因导入动物细胞
①方法： 技术。②受体细胞： 。
(3)将目的基因导入微生物细胞：常以 作为受体细胞，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能 的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
四．第四步：目的基因的检测与鉴定
(1)分子水平的检测
①通过 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因。
②利用PCR技术检测目的基因是否转录出了 。
③用相应抗体进行 检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
(2)个体生物学水平的鉴定： 实验等。
牛刀小试：判断正误
(1)PCR过程不需要解旋酶( )
(2)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均起始于启动子( )
(3)目的基因导入双子叶植物细胞一般采用农杆菌转化法( )
(4)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( )
(5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( )
(6)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术( )
【教学过程】
学习目标一：通过对抗虫棉案例的学习，阐述基因工程的基本操作程序主要包括哪些步骤。（20min）
任务一：，阅读课本76-80页回答下列问题
1．获取目的基因是实施基因工程的第一步，目前获取目的基因的常用方法有利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因等。聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的。请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识，回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
(2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？
(3)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
（4）经过n次循环后，有关PCR过程的计算
①n代后，DNA分子有_____个
②n代后，DNA链有_____条
③第____代出现完整的目的基因
④n代后，含引物的DNA分子有_____个
⑤n代后，共消耗_____个引物
⑥第n代复制，消耗了______个引物
⑦n代后，完整的目的基因有_____个
2．基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。填图并回答下列问题：
(1)完善基因表达载体构成图
(2)基因表达载体的构建需要 酶和 酶。
(3)目的基因的插入位点是随意的吗？为什么？
(4)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？
[小结一]1.目的基因的获取
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
说明 基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤； 从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
2.生物体内DNA复制与PCR反应的比较
比较项目 体内DNA复制 PCR反应
解旋 在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开 90 ℃以上高温下解旋，DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶 耐高温的DNA聚合酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链 在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成，再由DNA连接酶连接 分别从两条链的引物的3′端开始延伸，都是连续合成
过程
循环次数 受生物体自身控制 30多次
产物 完整DNA 两个引物之间的DNA片段
相同点 都需要DNA模板、4种脱氧核苷酸、分别与两条模板链相结合的两种引物；都是半保留复制，严格遵循碱基互补配对原则
3.启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
【评标】题组一1.(2022辽宁省六校联考)下面关于聚合酶链式反应(PCR)的叙述错误的是 (　　)
A.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
B.PCR的循环过程一般分为变性、复性和延伸三步
C.PCR技术利用DNA半保留复制的原理,可在短时间内大量扩增目的基因
D.一个目的基因用PCR扩增生成2n个目的基因的过程中需要2n+1个引物
2.(2021北京十一学校期中)用PCR扩增下面的DNA片段:
5'-3'-GCATCGCGTAGCTAGCATATGCCG…………CGATTAATCGGCGCGCATTATAGC-3'-5'
供选择的引物有:①5'-GACCTGTGGAAGC-3'、②5'-CATACGGGATTG-3'、③5'-GTATGCCCTAAC-3'、④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种,应选择 (　　)　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①② B.②③ C.③④ D.①④
3. (2022河南洛阳联考)如图是PCR扩增的过程示意图,其中叙述正确的是 (　　)
A.A过程不需要解旋酶参与
B.TaqDNA聚合酶是在B过程中发挥作用的
C.该过程需要一对特异性的引物,要求一对引物的序列是互补的
D.PCR反应体系只需要加入模板DNA、Taq DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸
题组二　基因表达载体的构建
4.水母发光蛋白由236个氨基酸构成,现已将决定这种蛋白质的基因作为基因工程技术的标记基因。在基因工程技术中,这种蛋白质的作用是 (　　)
A.促使目的基因导入受体细胞 B.促使目的基因在受体细胞中复制
C.使目的基因容易被检测出来 D.使目的基因容易成功表达
5.(2022天津西青杨柳青一中月考)下图为基因表达载体的模式图。下列相关叙述正确的是　 (　　)
A.甲表示启动子,位于基因的上游,它是DNA聚合酶识别和结合的部位
B.乙表示终止密码子,位于基因的下游,其作用是使转录过程停止
C.丙表示目的基因,其作用是获得人们所需要的性状
D.复制原点的存在有利于目的基因在受体细胞中扩增
6.(2022北京一五六中期中)如图为甲、乙、丙分别是目的基因、质粒载体、重组DNA(重组质粒)的三个示意图,限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。要获得理想的可表达目的基因的重组DNA,最佳的限制酶组合方式是 (　　)
A.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体 B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体 D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
【回标】7.(2021山东济宁期中)中科院动物研究所利用CRISPR/Cas9技术,向猪的基因组内插入一个解耦联蛋白基因(UCP1),经过基因改造的猪瘦肉率高、脂肪少、抗寒能力强。如图是基因改造过程中涉及的相关限制酶及酶切位点。请回答下列问题:
(1)图中的抗生素抗性基因的作用是作为　 　　　基因,以便于重组DNA分子的筛选。为了获取重组质粒,除了使用限制酶外,还需使用　　 　　酶。
(2)重组质粒上应有　　　 识别和结合的部位,以驱动解耦联蛋白基因(UCP1)转录,该部位称为　　 　　。
(3)在构建基因表达载体过程中,为避免出现质粒和目的基因自身连接,常用　　　 　　　两种限制酶同时切割质粒和UCP1基因。
任务二：；阅读课本80-82页，回答下列问题（20min）
1．将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。结合图1、图2、图3，根据教材相关内容完成下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞的方法有 和 等，其中由我国科学家独创的一种方法是 ，适用于双子叶植物和裸子植物的是 。
(2)农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？
(3)为什么植物基因工程常用的受体细胞可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？
(4)从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
2．目的基因导入受体细胞后，是否可以维持稳定和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。结合相关内容，回答下列问题：
(1)目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？
(2)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
[小结二]
1．目的基因导入不同受体细胞的过程
植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2．目的基因的检测与鉴定的方法
类型 检测内容 方法 结果显示
分子水平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)或PCR等 是否成功显示出杂交带
目的基因是否转录出mRNA 核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)或PCR等
目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)
个体生物学水平鉴定　 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性的接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性
【评标】题组三8.将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵,常用的方法分别是 (　　)
A.显微注射法、农杆菌转化法 B.显微注射法、花粉管通道法
C.农杆菌转化法、显微注射法 D.花粉管通道法、显微注射法
9.(2022江苏扬州期中改编)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述不正确的是 (　　)
A.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与
B.②→③可用氯化钙处理农杆菌,有助于重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中
C.③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上
D.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤不一定表现出抗虫性状
【回标】题组四　10.下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述,错误的是 (　　)
A.目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入细胞质DNA中
B.检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可采用PCR等技术
C.目的基因的鉴定可在个体生物学水平上进行
D.如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质,可确定目的基因首端含有启动子
11.(2022山东荣成一中月考)下列技术依据碱基互补配对原理的是 (　　)
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因　②检测目的基因是否转录出了mRNA　③检测目的基因是否翻译出蛋白质　④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
①②③④　　　　　　　B.①② C.①②④ D.①②③
12.(2022安徽安丰高级中学月考改编)DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时,形成标记的DNA-DNA(或标记的DNA-RNA)双链杂交分子,可检测杂交反应结果。依据人的生长激素基因序列制成DNA探针,对样品进行检测,以下不能与探针形成杂交分子的是 (　　)
A.胰岛B细胞的DNA B.胰岛B细胞的mRNA
C.垂体细胞的DNA D.垂体细胞的mRNA
【知识建构】
【随堂检测】
　1.(2022山东菏泽一中月考)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程,下列相关叙述错误的是 (　　)
A.用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因,同时用限制酶MunⅠ切割质粒
B.构建重组质粒时,会形成5种脱氧核苷酸序列(最多考虑DNA片段两两连接)
C.将重组质粒同时用以上2 种限制酶切割,则会再形成1 种长度的 DNA 片段
D.限制酶能识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割磷酸二酯键
2.将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞培育成抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒,图2中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,NeoR表示新霉素抗性基因,箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　)
A.农杆菌在自然情况下容易感染双子叶植物和裸子植物
B.为使目的基因与质粒高效重组,最好选用限制酶XbaⅠ和EcoRⅠ
C.成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素
D.可用抗虫接种实验检测杨树抗虫基因是否成功表达
3.(2022河北武强中学期中)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示,有关叙述正确的是 (　　)
A.过程①需使用反转录酶
B.过程②利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C.过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌,使之成为感受态细胞
D.过程④可利用抗原—抗体杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
4.菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述不正确的是 (　　)
A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上构建基因表达载体
C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
5.(2022北京丰台一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kiss1基因)仅在特定组织中表达。在雌激素诱导下,细胞内信号转导系统可以与kiss1基因启动子的特定区域结合,激活kiss1基因的转录。研究者扩增了kiss1基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。下列叙述不正确的是 (　　)
A.PCR获取不同长度片段时每组所用的引物有一个是统一的
B.应选择有kiss1基因且能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞
C.在细胞中表达出绿色荧光强度弱的片段具有较高的转录活性
D.该启动子能响应外源激素信号,可在基因工程中发挥重要作用
6.(多选)(2022河北石家庄元氏一中月考改编)下列关于基因工程的叙述,正确的是 (　　)
A.载体上的抗性基因作为标记基因,有利于目的基因的插入和表达
B.限制性内切核酸酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.目的基因由载体导入受体细胞
7.（12分）乙烯具有促进果实成熟的作用,ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术(原理如图1),可以抑制这两个基因的表达,从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。回答下列问题:
(1)从番茄细胞中提取RNA,利用RT-PCR技术获取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因,即利用RNA和PCR获取目的基因。该技术获取目的基因所需要的酶主要有　　　　　　　　　　　　　　　　（2分）。
(2)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点,ACC合成酶基因两端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点,这四种限制酶及其识别序列和切割位点如下表:
限制性内切核酸酶 识别序列和切割位点
BamHⅠ —G↓GATCC—
EcoRⅠ —G↓AATTC—
KpnⅠ —GGTAC↓C—
Sau3AⅠ —↓GATC—
先用限制酶　　　　　　　分别对ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后,再将它们拼接成融合基因,相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶　　　　　　　进行切割,以确保融合基因能够插入载体中。载体上卡那霉素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　 　（2分）。
为了获得耐储藏、宜运输的番茄,应将融合基因　　　　(填“正向”或“反向”)插入启动子2A11的下游,原因是　 （2分）。
(4)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时,　　　　(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测,理由是　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 （2分）。
得分 扣分
阅卷得分 审题规范（强化审题） 思维（析题）规范 呈现（答题）规范
采点计分 审题时间(3) 审清设问（层次化） 审读材料、情境（标注化） 析题时间(2) 角度步骤要点（角度化） 特别注意事项（对号化） 答题时间(4) 书写卷面(清晰化) 学科术语(术语化)
【课后作业】1.复习作业：依托本节课学案，整理本节课重难点及相关题型。
练习作业：
8.（8分）(2022山东日照青山学校期中)家禽饲料中富含纤维素,但家禽消化道中缺少降解纤维素的酶,阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员从枯草芽孢杆菌中分离出编码纤维素酶的W基因,并借助图1所示的质粒载体导入乳酸杆菌体内,以提高添加乳酸杆菌饲料的利用率,节省成本。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段。回答下列问题:
(1)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,是　　　　识别和结合的部位。多数启动子具有物种特异性,为满足应用需要,在图1质粒中插入W基因的上游应选择　　 　　(填“枯草芽孢杆菌”或“乳酸杆菌”)的启动子。
(2)分析两图可知,应使用限制酶　　　　　　切割质粒和含W基因的DNA片段,以获得W基因能正确连接的重组质粒。所得重组质粒导入乳酸杆菌后,使用含　　 　　　　的培养基筛选,以得到成功导入W基因的乳酸杆菌。
(3)将纤维素含量为20%的培养基分为甲、乙、丙三组,其中甲组接种乳酸杆菌,乙组接种导入重组质粒的乳酸杆菌,丙组接种导入普通质粒的乳酸杆菌。相同条件下培养一段时间,发现甲、丙两组培养基中纤维素的含量无变化,而乙组含量下降,试从分子水平简要阐述出现上述结果的原因:　　　　　　　 　　　　　　　　　　　
　　　 （2分）。
(4)有人认为,增加导入W基因的数量会提高转基因乳酸杆菌降解纤维素的能力。请设计一个实验方案加以判定。(简要写出实验思路)（2分）
3.预习作业：依托下节课学案熟悉相关知识点，勾画重难点，写出困惑。
答案
【课前预习15min】
一、筛选与获取 基因表达载体的构建 导入受体细胞 检测与鉴定。
2．改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因 编码蛋白质的基因。Bt抗虫蛋白基因
3．相关的已知结构和功能清晰的基因
4．人工合成 PCR特异性地快速扩增 构建基因文库
5． (1) 聚合酶链式反应 体外 核苷酸序列
(2) DNA半保留复制。
(3) 缓冲溶液 Mg2＋ ② DNA母链。③ 4种脱氧核苷酸。④ 耐高温的DNA聚合酶 ⑤引物： 引物的3′端
(4) 超过90 ℃ 解聚 ② 下降到50 ℃ 两种引物 ③ 上升到72 ℃ 耐高温的DNA聚合酶
(5) 琼脂糖凝胶电泳
二、基因表达载体的构建
1． 稳定存在 表达和发挥作用。
2．
限制酶 (2) 同种限制酶或能产生相同末端 (3) DNA连接酶
三．将目的基因导入受体细胞
(1) 子房 受粉后 DNA溶液 借助花粉管通道进入胚囊。
②维持稳定和表达 Ti质粒 T DNA 染色体DNA
(2)① 显微注射 ② 受精卵。
(3) 大肠杆菌 Ca2＋ 吸收周围环境中DNA分子
四．目的基因的检测与鉴定
(1) PCR等技术 ② mRNA。③抗原—抗体杂交 (2) 抗虫、抗病接种
牛刀小试 √×√×√×
【教学过程】
学习目标一：1.（1）引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。原因：在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。
(2)不需要，只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。
（4）2n 2n+1 3 2n 2n+1-2 2n 2n-2n
2.RNA聚合酶 转录 下游 目的基因
(2)限制酶 DNA连接酶。
(3)不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原有的功能。
(4)不相同。启动子和终止子位于DNA上，是基因表达必需的部分；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
【评标】1.D　PCR是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术(教材第77页),其循环过程一般可分为三步:变性、复性和延伸,其产物常采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,A、B、C正确。根据DNA半保留复制特点可知,随着重复次数的增多,DNA分子以2n的形式增加,共有-2个引物参与子代DNA分子的合成,D错误。
2.D　用PCR扩增DNA片段的过程中,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端→3'端延伸的,故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同,即应以模板链5'端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物;由题干信息分析可知,5'端的碱基序列是5'-GACCTGTGGAAGC和5'-CAATCCCGTATG,故对应的引物为①5'-GACCTGTGGAAGC-3'和④5'-CAATCCCGTATG-3',故选D。
3.A　分析题图:A是变性过程,B为复性过程,C为延伸过程。变性过程中高温会破坏DNA双链间的氢键,从而达到解旋的目的,因此A过程不需要解旋酶的参与,A正确;Taq DNA聚合酶是在C延伸过程中发挥作用的,B错误;该过程需要一对特异性的引物,要求一对引物的序列是不互补的,否则会影响目的基因的扩增,C错误;PCR反应体系需要加入模板DNA、Taq DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸和两种引物,D错误。
4.C　标记基因不能促使目的基因导入受体细胞,A不符合题意;复制原点有利于目的基因在受体细胞中复制,标记基因不能促使目的基因在受体细胞中复制,B不符合题意;水母发光蛋白基因可以表达出发光蛋白,使目的基因容易被检测出来,C符合题意;标记基因与目的基因的表达没有直接关系,D不符合题意。
5.D　基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点等,其中启动子位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,则甲表示启动子;终止子位于基因的下游,作用是使转录过程停止,则乙表示终止子;标记基因用于筛选含有目的基因的受体细胞,则丙表示标记基因;复制原点的存在有利于目的基因在受体细胞中扩增。综上可知,A、B、C错误,D正确。
6.D　用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体,在构建的重组DNA(重组质粒)中,RNA聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才与图丙相同,D正确。
【回标】7.答案　(1)标记　DNA连接　(2)RNA聚合酶　启动子　(3)BamHⅠ和HindⅢ
解析(3)在构建基因表达载体的过程中,使用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶同时切割质粒和含UCP1基因的外源DNA,可以避免出现质粒和目的基因(UCP1基因)自身连接。
任务二：1．(1)农杆菌转化法 花粉管通道法 花粉管通道法 农杆菌转化法。
（2）农杆菌中Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
(4)不可以。因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
2．(1)目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，这是其能否在真核生物中稳定遗传的关键。可以用DNA分子杂交、PCR等技术进行检测。
(2)用叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，抗虫基因没有表达。
【评标】8.C　大豆是双子叶植物,农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法;显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
9.C　②→③可用氯化钙处理农杆菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这样有助于重组Ti质粒转化到农杆菌细胞中,B正确;农杆菌侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上(教材第81页),故用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒的T-DNA片段整合到植物细胞的染色体上,C错误;染色体上含有抗虫基因,但抗虫基因可能不能转录或翻译,或者表达的蛋白质不具有生物活性,就会导致植物不能表现出抗虫性状,D正确。
【回标】10.A　目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入核DNA中;检测目的基因是否导入受体细胞或检测目的基因是否转录出了mRNA可采用PCR等技术;目的基因能成功表达,说明其首端含有启动子。
11.B　检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因、检测目的基因是否转录出了mRNA可采用PCR等技术,其原理是碱基互补配对,①②符合题意;检测目的基因是否翻译出蛋白质可采用抗原—抗体杂交技术,不存在利用碱基互补配对原理,③不符合题意;通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性,属于个体生物学水平检测,不存在利用碱基互补配对原理,④不符合题意。
12.B　胰岛B细胞、垂体细胞中含有人的生长激素基因,其DNA可与探针形成杂交分子,A、C不符合题意。人的生长激素基因只在垂体细胞中表达,则垂体细胞中人的生长激素基因会转录出相应的mRNA,该mRNA能与探针形成杂交分子,D不符合题意。胰岛B细胞中人的生长激素基因不表达,该细胞中的mRNA不能与探针形成杂交分子,B符合题意。
【随堂检测】
题组一　1.B　目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点,因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子;质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点,但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中,用其切割会破坏标记基因,因此应选用限制酶MunⅠ切割质粒,A正确。最多考虑DNA片段两两连接时,DNA拼接时可能形成不拼接的两种核苷酸序列,目的基因与目的基因同方向拼接和不同方向拼接两种,质粒与质粒同方向拼接和不同方向拼接两种,质粒与目的基因同方向拼接和不同方向拼接两种,共8种,B错误。切割后的质粒与目的基因连接形成重组质粒,连接处形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列,不能被题中的2 种限制酶识别、切割,但EcoRⅠ能识别重组质粒中标记基因中的相应序列并切割,使重组质粒断裂形成1种长度的DNA片段,C正确。
2.B　农杆菌是一种在土壤中生活的微生物,能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物(教材第81页),A正确。由分析可知,为使目的基因与质粒高效重组,最好选用限制酶EcoRⅠ和PstⅠ同时切割目的基因和质粒,B错误。选用限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割质粒,氨苄青霉素抗性基因被破坏,新霉素抗性基因完好,故成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素,C正确。可用抗虫接种实验检测杨树抗虫基因是否成功表达,若杨树表现出抗虫性,则杨树抗虫基因成功表达,D正确。
3.A　过程①表示反转录,需要反转录酶的催化,A正确;在利用PCR技术对获取的目的基因进行扩增的过程中,不需要使用解旋酶,B错误;过程③表示将重组表达载体导入大肠杆菌,需要用CaCl2溶液处理大肠杆菌,使之成为感受态细胞,C错误;过程④可利用PCR等技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞,而抗原—抗体杂交技术可鉴定目的基因是否成功表达,D错误。
4.A　要获得转基因菊花,可以选择菊花叶片细胞作为受体细胞,但不能选择桃蚜细胞作为受体细胞,A错误;Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞中,并且整合到受体细胞染色体DNA上,根据这一特点,构建基因表达载体时,应该将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上,B正确;菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞,有利于目的基因成功导入,C正确;已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,故应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度,D正确。
5.C　结合图示可知,构建不同长度的片段P1、P2、P3、P4与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,与G融合的那段是一样的,即下游引物是一样的,但上游引物不同,A正确;该实验要探究不同片段的转录活性,应选择有kiss1基因且能表达的小鼠细胞作为转化的受体细胞,B正确;若某片段转录,则绿色荧光蛋白基因也表达,在细胞中表达出绿色荧光强度强的片段具有较高的转录活性,C错误;在雌激素诱导下,细胞内信号转导系统可以与kiss1基因启动子的特定区域结合,激活kiss1基因的转录,该启动子能响应外源激素信号,可在基因工程中发挥重要作用,D正确。
6.BCD　载体上的抗性基因作为标记基因,有利于筛选含重组DNA的细胞,但不能促进目的基因的插入和表达,A错误;大肠杆菌是原核生物,其细胞中无内质网和高尔基体,不能对胰岛素原进行加工,因此人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性,C正确。
7.答案　(1)反转录酶和耐高温的DNA聚合酶
(2)BamHⅠ和Sau3AⅠ　EcoRⅠ和KpnⅠ　便于重组DNA分子的筛选　(3)反向　只有反向插入,转录出的mRNA才能和目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA,使目的基因不能表达出两种酶,从而抑制乙烯的合成　(4)不能　番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因,能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交
解析　(1)通过RNA 获取目的基因应使用反转录酶,而通过PCR技术扩增目的基因应使用耐高温的DNA聚合酶。(2)因为合成出的 ACC 氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点,ACC合成酶基因两端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点,而限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ切割出来的黏性末端相同,可将ACC 氧化酶基因和ACC 合成酶基因拼接成融合基因,最后对相应的Ti 质粒和融合基因均使用限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ进行切割,以确保融合基因能够插入载体中,载体上的卡那霉素抗性基因作为标记基因,其作用是便于重组DNA分子的筛选。(3)为了获得耐储藏、宜运输的番茄,应将融合基因反向插入启动子2A11的下游,因为只有反向插入,转录出的mRNA才能和目的基因转录出的mRNA形成互补双链RNA,使目的基因不能表达出两种酶,从而抑制乙烯的合成。(4)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时,不能用放射性物质标记的ACC 氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测,理由是番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因,能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交。
【课后作业】
8.答案　(1)RNA 聚合酶　乳酸杆菌　(2)EcoRⅠ和HindⅢ　氨苄青霉素　(3)W基因在乳酸杆菌中成功表达出分解纤维素的酶　(4)将不同拷贝数的W 基因分别导入乳酸杆菌体内,比较各转基因乳酸杆菌降解纤维素的能力差异。
解析　(4)由题意可知,实验的自变量为W基因的数量,因变量为乳酸杆菌降解纤维素的能力,故可设计实验方案:将不同拷贝数的W 基因分别导入乳酸杆菌体内,比较各转基因乳酸杆菌降解纤维素的能力差异。

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